Вспомогательный хэтчинг: показания, применение, результаты
|
ЗП также выполняет защитную функцию, ограждая и предохраняя эмбрион во время его прохождения по маточным трубам. Благодаря ЗП происходит компактизация бластомеров на стадии морулы. Во время преимплантационного развития эмбриона наблюдается истончение ЗП, и на 5–7-й день после овуляции происходит хэтчинг бластоцисты. Хэтчинг является одним из ключевых событий преимплантационного развития эмбриона, после завершения которого эмбрион входит в прямой контакт с эндометрием матки.
Механизм естественного хэтчинга известен. Раньше предполагалось, что только давление расширяющейся бластоцисты на ЗП играет основную роль в процессах хэтчинга. Однако на разрыв ЗП действуют как экспрессия литических ферментов самого эмбриона, так и его маточное окружение. Показано, что непосредственно перед хэтчингом трофэктодерма эмбриона экспрессирует трипсин-подобную протеиназу – стрипсин, а добавление ингибиторов протеиназ в культуральную среду полностью тормозит хэтчинг. Однако не всегда бластоциста может освободиться из ЗП, и даже морфологически нормальные эмбрионы (по некоторым данным до 75%) навсегда остаются “узниками” ЗП при культивировании в условиях in vitro. В настоящее время существует такой термин “затвердевание” ЗП, обусловленное молекулярными изменениями в ЗП. Такая модификация гликопротеинов приводит к повышению резистенции ЗП и к ее неспособности расщепляться под действием литических ферментов. Указывается, что интенсивное затвердевание ЗП происходит в яйцеклетках, полученных у женщин старшей возрастной группы, что возможно обусловлено эндокринными изменениями. Культивирование эмбрионов in vitro также может индуцировать затвердевание ЗП, что может быть объяснено отсутствием в культуральной среде некоторых лизинов, которые могут действовать на эмбрион в условиях in vivo. Возможно, что у некоторых пациенток, проходящих курс лечения по поводу бесплодия, могут продуцироваться ооциты, экспрессирующие дефектный лизин или пониженный его уровень, что в комбинации с условиями культивирования in vitro может привести к неспособности к хэтчингу [17]. Криоконсервация ооцитов и эмбрионов влияет на гликопротеины ЗП, что также приводит к затвердеванию ЗП. У пациенток, принимающих гормональные препараты с целью стимуляции яичников, относительно низкая частота имплантации эмбрионов после ЭКО-ПЭ может быть частично обусловлена асинхронностью между развитием эмбриона и окном имплантации в эндометрий. Естественный хэтчинг происходит примерно через 120 ч (5 дней) после оплодотворения. Имплантация в естественном нестимулированном цикле возможна через 120 ч после оплодотворения, и продолжительность окна имплантации (присутствие в эндометрии пиноподий) составляет примерно 48 ч, т.е. эмбрион может имплантироваться только в промежутке 120–168 ч после оплодотворения. В стимулированных циклах окно имплантации сдвигается и имеет место через 72–120 ч после оплодотворения. Если хэтчинг происходит естественно через 120 ч после оплодотворения, то эмбрионы имеют ограниченное время для имплантации в стимулированных циклах [19]. Таким образом, применение вспомогательного хэтчинга (ВХ) способствует увеличению частоты имплантации посредством 1) преодоления проблем, связанных с затвердеванием ЗП, и 2) более раннего контакта эмбриона с эндометрием, что ведет к инициации имплантации. За низкую частоту имплантации эмбрионов после ЭКО-ПЭ отвечает ряд факторов, включая отсутствие естественного хэтчинга у переносимых эмбрионов. Показано, что рассечение ЗП ведет как к более раннему хэтчингу, так и к увеличению частоты хэтчинга у бластоцист, культивируемых в условиях in vitro. Также было отмечено, что после переноса эмбрионов, полученных при помощи вспомогательного оплодотворения (частичное рассечение зоны –PZD), частота имплантации выше. На основании этих наблюдений с целью помочь эмбриону высвободиться из ЗП стали применять ВХ. В настоящее время существует несколько подходов к проведению ВХ в программе ЭКО-ПЭ: 1) с помощью метода, впервые примененного Jacques Cohen, – используя кислый раствор Тироде и микропипетку, образуют в ЗП отверстие диаметром 20–30 мкм. Эту процедуру обычно выполняют на 2–3-й день после аспирации фолликулов; 2) путем механического рассечения ЗП. С помощью микроиглы и микроманипуляторов делают небольшое рассечение ЗП; 3) с помощью лазера. Результаты и показания для применения ВХ Первое серьезное исследование, посвященное применению ВХ в лечении бесплодия с помощью ЭКО-ПЭ, было опубликовано в 1992 г. J. Cohen и соавт. [11]. В этой работе в группе, где проводили ВХ, частота наступления клинической беременности составила 51,8% и частота имплантации эмбрионов – 26,5%, тогда как в контроле – соответственно 37,3 и 18,7%. Наибольшая эффективность применения ВХ отмечена у пациенток с повышенным базальным уровнем ФСГ, у которых частота наступления беременности составила 47% против 13% в контрольной группе, а частота имплантации – 26% против 10%. В группе, где применяли ВХ, у пациенток старше 39 лет частота имплантации составила 16% по сравнению с 3% в контроле. Рандомизированные исследования, проведенные P. Brinsden и соавт. [10], также показали эффективность применения ВХ в отдельных группах: у пациенток с повышенным уровнем ФСГ; у пациенток, эмбрионы которых имеют утолщенную ЗП; у пациенток старше 39 лет. W. Schoolcraft и соавт. [18,19] после применения ВХ получили частоту наступления беременности 55,3% и частоту имплантации 26,6%. Показания для выполнения ВХ – предшествующие неудачные попытки имплантации, повышенный уровень ФСГ, возраст женщины 39 лет и старше, а также эмбрионы с плохими морфологическими показателями. Такие случаи составили примерно 60%. Наибольший эффект был получен в группе пациенток старше 39 лет. Общеизвестно, что у женщин старше 40 лет частота наступления беременности при лечении бесплодия методом ЭКО-ПЭ значительно снижается. Был проведен ретроспективный анализ на 275 циклах у пациенток в возрасте от 40 до 43 лет [23]. При переносе 3 эмбрионов и более после выполнения ВХ частота наступления беременности составила 26,9% (при переносе эмбрионов без ВХ –11,8%). Эти результаты подтверждают гипотезу, что существуют определенные проблемы с естественным хэтчингом у эмбрионов, полученных у женщин старшей возрастной группы. Эти проблемы связаны с неспособностью таких эмбрионов к имплантации. ЗП, формирующаяся во время созревания ооцитов, может иметь химические и/или физические характеристики, которые могут отличаться от таковых у ооцитов, полученных от молодых пациенток. Такая ЗП более резистентна к лизину, экспрессирующемуся в эмбрионе. Выполняя ВХ, мы помогаем эмбриону преодолеть проблемы, связанные с естественным хэтчингом, что позволяет ему имплантироваться. По мнению P. Brinsden и соавт. [10], ВХ может помочь только определенной категории пациенток, а именно женщинам старше 40 лет. Аналогичное мнение выражают A. Stein и соавт. [22], которые отмечали одинаковую частоту наступления клинической беременности в группах с применением ВХ и без него в общей популяции больных, проходящих лечение методом ЭКО-ПЭ. Однако анализ показал, что в группе пациенток старше 39 лет применение ВХ увеличило частоту наступления беременности до 23,9% по сравнению с 7% в контроле. G. Letterie и соавт. [15] показали эффективность применения ВХ для увеличения частоты наступления беременности у пациенток с плохим прогнозом и у пациенток программы ИКСИ. Частота наступления беременности после выполнения ВХ в этих двух группах была значительно выше (50 и 42% соответственно) по сравнению с контролем – без ВХ (33%). Однако, по данным M. Tucker и соавт. [26], BХ не оказал существенного влияния на исход циклов ИКСИ в плане как частоты наступления беременности (30% против 32,0% в контроле) и частоты имплантации ( 8,5% против 13,5% в контроле). Тем не менее в группе женщин старше 35 лет применение ВХ на эмбрионах, полученных после ИКСИ, значительно увеличило частоту наступления клинической беременности и частоту имплантации (35,5 и 10,3% соответственно против 11,1 и 3,1% в контроле). A. Stein и соавт. [22] провели проспективное исследование влияния ВХ на частоту имплантации в различных группах пациенток. Наибольшая эффективность ВХ была выявлена у пациенток старше 41 года и имеющих по крайней мере 3 неудачные попытки переноса эмбрионов. Отмечено, что несколько повторных неудачных попыток переноса эмбрионов не является показанием к выполнению ВХ. А у пациенток моложе 36 лет данная процедура даже может снизить частоту имплантации. Следует отметить, что в работе D. Bider и соавт. [8] ВХ не оказал существенного влияния на исход циклов ЭКО-ПЭ даже в группе женщин старше 38 лет. В общей сложности 839 эмбрионам от 211 пациенток был проведен ВХ. Контролем служили 540 эмбрионов, которые перенесли 174 пациенткам. Частота наступления беременности составила соответственно 8,9 и 5,1%, а частота имплантации – 3,75 и 3,55%. Частота “take-home baby” практически не различалась – 3,8% в группе с ВХ и 3,4% в контроле. В экспериментальной работе было показано, что 100% замороженных-оттаянных двухдневных эмбрионов начинают хэтчинг после выполнения ВХ, тогда как в контроле – только 21% [16]. J. Tao и R. Tamis [24] отметили увеличение частоты наступления беременности и имплантации после выполнения ВХ у криозамороженных-оттаянных эмбрионов. ВХ с помощью лазера Некоторые клиники используют для выполнения ВХ различные лазерные системы [1–6, 13, 18]. Авторы указывают, что при выполнении лазерного вспомогательного хэтчинга (ЛВХ) возможно точно контролировать форму и размеры генерированной бреши в ЗП, что нельзя сделать при механическом ВХ. S. Antinori и соавт. [4] использовали бесконтактный УФ-лазер для выполнения ЛВХ у 4–6-клеточных эмбрионов, полученных у пациенток (средний возраст 38 лет) с 2–4 неудачными предыдущими циклами ЭКО-ПЭ. Частота наступления клинической беременности составила 36,4%, частота имплантации – 9,3% в группе с применением ВХ и соответственно 19,3 и 5,1% в контроле. В другой работе этих же авторов [5] были представлены результаты применения ЛВХ у 846 пациенток. Частота наступления беременности в группе с ЛВХ составила 49% (221 из 431) по сравнению с 23,3% (97 из 415) в контроле, частота имплантации – соответственно 18,8 и 7%. После использования данной лазерной технологии родилось более 80 нормальных здоровых детей, что подтверждает ее безопасность. В следующей работе, S. Antinory и соавт. [6] изучили эффективность применения лазера на 48-часовых (2 бластомера) и на 72-часовых (4–6 бластомеров) эмбрионах. Перенос эмбрионов осуществляли сразу после выполнения ЛВХ. В обеих группах пациенток были схожие параметры: отсутствие имплантации в 3–4 попытках ЭКО-ПЭ, повышенный уровень эстрадиола (18 МЕ/мл) и возраст старше 37 лет. Частота наступления клинической беременности после переноса эмбрионов на 2-й или 3-й день составила 30,8 и 49,3%, а частота имплантации – 12,8 и 20,1% соответственно. Эти данные показывают, что ЛВХ и перенос эмбрионов, выполненные на 3-й день, более эффективны. F. Azem и соавт. [7] показали, что применение ЛВХ у женщин с повторными неудачными циклами ЭКО-ПЭ значительно улучшает частоту имплантации. Пациентки, которые имели по крайней мере 4 неудачных цикла ЭКО-ПЭ, были включены в исследование. Частота наступления клинической беременности в группе с ЛВХ составила 17,5% по сравнению 5,5% в контроле. Полное удаление ЗП Одной из разновидностей ВХ можно считать полное удаление ЗП с помощью проназы. В последнее время опубликованы данные, свидетельствующие, что перенос эмбрионов на 5-й день увеличивает частоту имплантации. Был использован новый подход к выполнению ВХ – использование проназы для полного удаления ЗП у эмбрионов, находящихся на стадии бластоцисты (применение механического ВХ или ВХ с помощью кислого раствора Тироде травматично на данной стадии) [9]. C. Fong и соавт. [14] сообщили о первой беременности, полученной после переноса zona-free эмбрионов. Для удаления ЗП у эмбрионов, находящихся на стадии бластоцисты, использовали 0,5% раствор проназы. После переноса 4 обработанных таким образом бластоцист у 37-летней пациентки, имеющей 9 неудачных предшествующих попыток переноса эмбрионов, наступила нормальная прогрессирующая беременность. Заключение Таким образом, ВХ не оказывает значительного влияния на частоту наступления беременности как в обычных циклах ЭКО, так и в циклах ИКСИ в общей популяции пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО-ПЭ. У молодых женщин применение ВХ даже может привести к снижению частоты имплантации эмбрионов. Причина этого не совсем ясна. Возможно существует вероятность потери бластомера или части эмбриона через образованное отверстие в ЗП. Также возможно, что после таких микроманипуляций хэтчинг произойдет значительно раньше обычного, на стадии, когда эмбрион еще не достиг бластоцисты. Однако у женщин позднего репродуктивного возраста (по данным разных авторов это возраст 35–41 год) применение ВХ может увеличить частоту наступления беременности и частоту имплантации [24–27]. В некоторых случаях ВХ может также быть эффективен у пациенток, которые имели множественные неудачные попытки переноса эмбрионов, а также у пациенток, чьи эмбрионы имеют замедленное развитие, плохие морфологические показатели или анормальные биометрические характеристики ЗП [12]. Данные показания относятся к пациенткам, проходящим лечение бесплодия с помощью как стандартного ЭКО, так и ИКСИ. ВХ следует также выполнять при переносе замороженных-оттаянных эмбрионов. В связи с намечающейся тенденцией некоторых клиник проводить перенос эмбрионов на 5-й день перспективным кажется полное удаление ЗП с помощью проназы. Таким образом, вследствие все более широкого распространения криоконсервации эмбрионов, увеличения процента пациенток старшей возрастной группы и других “трудных” случаев ВХ должен стать рутинным добавлением к существующим методам ЭКО. Редакция журнала благодарит компанию “ОРГАНОН” (Голландия) за возможность использования сети Medline-Internet при написании настоящего обзора. Литература 1. Antinori S. et al. Seventeen live births after use of an erbium-YAG laser in the treatment of male factor infertility. 1994; 9: 1891—1896. 2. Antinori S. et al. Zona thinning with the use of laser: a new approach to assisted hatching in human. Hum Reprod 1995; 3: 101—105. 3. Antinori S. et al. Improving the implantation rate in ICSI with use of ER-YAG laser. J Assist Reprod Genet 1995: 12: OC-323: Abstract. 4. Antinori S. et al. Zona opening of human embryos using a non-contact UV laser for assisted hatching in patients with poor prognosis of pregnancy. Hum Reprod 1996; 11: 11: 2488—2492. 5. Antinory S. et al. Laser assisted hatching: Comparison between assisted hatching on 48 h and on 72 h stages embryos. 10th World Congress on in vitro fertilization and assisted reproduction. Vancouver. 1997. 6. Antinori S. et al. Experience with the UV non contact laser in assisted hatching in human. J of Assist Reprod and Genet 1997; 14: 5: Abstract. 7. Azem F. Erbium-Yttrium-aluminium-garnet laser-assisted zona hatching improves in vitro fertilization-embryo transfer outcome in women with repeated failures. J of Assist Reprod and Genet 1997; 14: 5: Abstract. 8. Bider D. et al. Assisted hatching by zona drillling of human embryos in woman of advanced age. Hum Reprod 1997; 12: 2. 9. Bongso A. et al. Improving the success of human IVF through day 5 and 6 transfers: the use of improved in vitro systems. J of Assist Reprod and Genet 1997; 14: 5: Abstract. 10. Brinsden P. et al. Clinical benefits of assisted hatching. 10th World Congress on in vitro fertilization and assisted reproduction. Vancouver. 1997. 11. Cohen J. et al. Implantation enhancement by selective assisted hatching using zona drilling of human embryos with poor prognosis. Hum Reprod 1992; 5: 685—691. 12. Feichtinger et al. Photoablation of oocyte zona pellucida by Erbium YAG laser for in vitro fertilization in severe male infertility. Lancet 1992; 339: 811. 13. Cohen J et al. Advanced laboratory techniques for assisted reproduction. Infertil Reprod Med 1993; 4: 733—759. 14. Fong C.Y. et al. Ongoing normal pregnancy after transfer of zone-free blastocysts: implications for embryo transfer in human. Hum Repro 1997; 12: 557—560. 15. Letterie G. et al. Beneficial effect of assisted hatching for poor prognosis alone and in conjunction with intracytoplasmic sperm injection for both poor prognosis and severe male factor candidates. 10th World Congress on in vitro fertilization and assisted reproduction. Vancouver 1997 16. Mandelbaum J. et al. The effects of partial zona dissection on in vitro development and hatching of human cryopreserved embryos. Hum Reprod 1994; 9: 4: Abstracts. 17. Nordstrom A.M. Assisted hatching -is it worthwhile? Alpha 1997; 10. 18. Obruca A. et al. Use of lasers in assisted fertilization and hatching. Hum Reprod 1994; 9: 1723-1726. 19. Schoolcraft W.B. et al. Assisted hatching in the treatment of poor prognosis in vitro fertilization candidates. Fertil Steril 1994; 62: 551—554. 20. Schoolcraft W.B. et al. Assisted hatching improves the implantation rate. 10th World Congress on in vitro fertilization and assisted reproduction. Vancouver 1997. 21. Stein A. et al. The contribution of assisted hatching to implantation rate in relation to patient age: its role in younger women with repeated implantation failure. Hum Reprod 1994; 9: 4: Abstracts. 22. Stein A. et al. Assisted hatching by partial zona dissection in human preembryos in patients with recurrent implantation failure after in vitro fertilization. Fertil Steril 1995; 63: 838—841. 23. Summer D. et al. Assisted embryo hatching improves pregnancy rates (PRs) in woman aged 40-43 years. 10th World Congress on in vitro fertilization and assisted reproduction. Vancouver 1997; 909—913. 24. Tao J., Tamis R. Application of assisted hatching for 2-day-old, frozen-thawed embryo transfer in a poor-prognosis population. J of Assist Reprod Genet 1997; 14: 2. 25. Tucker M.J. et al. Assisted hatching with and without bovine oviductal epithelial cell coculture for poor prognosis in vitro fertilization patients. Hum Reprod 1994; 9: 1528—1531. 26. Tucker M.J. et al. Enhancement of outcome from intracytoplasmic sperm injection: does co-culture or assisted hatching improve implantation rate? Hum Reprod 1996; 11: 11: 2434—2437. 27. Wiemer K.E. et al. The combination of coculture and selective assisted hatching: results from teir clinical application. Fertil Steril 1994; 61: 105—110. 28. Wiemer K.E. Beneficial aspects of coculture with assisted hatching when applied to multiple-failure in-vitro fertilization patients. Hum Reprod 1996; 11: 11: 2429—2433. П.А.Гоголевский Московский центр по лечению бесплодия ЭКО |