Тезисы II Международного симпозиума по преимплантационной генетике
|
Получение кДНК-библиотеки из единичного преимплантационного эмбриона человека
Получены кДНК-библиотеки из неоплодотворенных ооцитов и эмбрионов человека, находящихся на 4-, 7-клеточной стадии и стадии бластоцисты. Библиотеки представляли полный набор активных генов, экспрессирующихся на ранних. Сокультивирование, биопсия бластоцист и применение методов молекулярной биологии в преимплантационной диагностике У 24 бластоцист была произведена биопсия, и 252 полученных бластомера были исследованы на хромосомы 13, 18, 21, X и Y с помощью FISH-анализа. Частота мозаицизма (анеуплоидия и миксоплоидия) составила 27%. У 17 (6,7%) бластомеров была анеуплоидия, у 51 (20,2%) — полиплоидия (от 3n до 8n). SRY (Yp) и DAZ (Yq) локусы были успешно амплифицированы в 11 бластоцистах. Амплификация GABA локуса (15q) наблюдалась только в 17 бластоцистах. Применение FISH диагностики до проведения ICSI в случаях тяжелой тератозооспермии В определенных случаях тератозооспермии возможен блок мейоза во время сперматогенеза, и в такой ситуации проведение ICSI проблематично. У пациента, проходившего курс лечения бесплодия, была выявлена тяжелая форма тератозооспермии (100% морфологически анормальных сперматозоидов). При использовании FISH-метода для анализа кариотипа сперматозоидов были получены сигналы для хромосом X, Y и 2 сигнала для хромосомы 18. В данном случае мейоз не был завершен, в то время как спермиогенез частично закончился. Пациент был исключен из программы ICSI. Нерасхождение 21 хромосомы в сперматозоидах человека Изучали появление дисомии хромосомы 21 в сперматозоидах от отцов, дети которых страдали синдромом Дауна, и сравнивали с контролем. Был использован FISH-анализ с локусспецифичным ДНК-зондом для хромосомы 21 и зондом для центромеры хромосомы 6 в качестве контроля. Результаты в контрольной серии экспериментов показали, что появление дисомии 21-й хромосомы (0,38%) значительно выше, чем для 6-й хромосомы (0,14%). У пациентов, дети которых имели синдром Дауна, обнаружены значительные межиндивидуальные различия (0,17 — 0,78%). Делеции митохондриальной ДНК (мтДНК) в ооцитах и эмбрионах человека Делеции мтДНК в неоплодотворенных ооцитах можно использовать как маркер старения ооцитов. Используя метод ПЦР изучали вопрос, являются ли делеции мтДНК ооцитов и эмбрионов характерным признаком женщин старшего возраста или более молодых женщин. Результаты показали, что единичные яйцеклетки и эмбрионы содержат ПЦР-продукты, соответствующие делетированной мтДНК. Делеции мтДНК обнаружены приблизительно в 28,9% яйцеклеток и эмбрионов. Созревание ооцитов человека in vitro Восемнадцать женщин проходили 31 лечебный цикл, в котором незрелые ооциты были извлечены в середине фолликулярной фазы. В 22 случаях аспирация была произведена успешно, и было получено 126 ооцитов, из которых 109 находились на стадии GV. Через 48 ч культивирования in vitro 12,8% из этих 109 ооцитов дегенерировали, 17,4, 10,1, и 59,6% были на стадиях GV, MI и MII соответственно. 85 ооцитов, находящихся на стадии МII, были инсеминированы с помощью ИКСИ и на следующий день 54 (63,5%) ооцита показали нормальное оплодотворение. Было проведено 14 переносов эмбрионов. Ни в одном случае беременность не наступила. Преимплантационная генетическая диагностика спинальной мышечной атрофии (SMA) SMA — второе наиболее распространенное летальное аутосомно-рецессивное заболевание на Кавказе. Частота рождения детей с этим заболеванием составляет примерно 1 на 6000. Три формы SMA картированы на хромосоме 5q13; ген SMN недавно был идентифицирован и обнаруженные в нем мутациии коррелируют с появлением SMA. Делеции в экзоне 8 и/или 7 гена SMN встречаются у 98,6 и 93% больных SMA независимо от сложности заболевания. Разработан протокол для проведения ПЦР с целью определения данных делеций в единичных клетках, и в настоящее время стало возможным предложить супружеским парам, имеющим риск рождения детей с SMA, преимплантационную диагностику в рамках ЭКО. Влияние экспериментально индуцированной фрагментации эмбрионов на преимплантационное развитие мыши Недавно было показано что удаление цитоплазматических фрагментов благоприятно сказывается на дальнейшем развитии эмбрионов до стадии хэтчинга. Было изучено влияние клеточной фрагментации, индуцированной микрохирургически у мышиных эмбрионов, находящихся на поздней пронуклеарной стадии и 8-клеточной стадии, на их дальнейшее преимплантационное развитие. Обнаружено, что фрагменты, индуцированные на поздней пронуклеарной стадии, не влияют ни на число эмбрионов, развивающихся до стадии хэтчинга, ни на общее число клеток в бластоцисте. Сокращение неудач при аллелеспецифической амплификации ДНК из гетерозиготных клеток для преимплантационной диагностики Нарушение амплификации специфических аллелей в гетерозиготных единичных клетках может привести к неправильному диагнозу и переносу пораженных определенной болезнью эмбрионов. Проведено сравнение двух различных лизирующих буферов, которые используются в протоколах проведения ПЦР. Показано, что применение буфера, содержащего SDS/протеиназу К, ведет к 100% амплификации аллелей гетерозиготных клеток, а применение буфера KOH/DTT — к 90% амплификации. Факторы влияющие на эффективность ИКСИ у мышей Используя ооциты мыши в качестве модели изучали влияние различных типов игл, средовых добавок, температуры, времени после введения чХГ, а также инъекции целого сперматозоида или только его головки на частоту оплодотворения и последующего преимплантационного развития. Наилучшие результаты (выживаемость 87%, частота оплодотворения 86%, частота дробления 67%) были получены, когда головку сперматозоида инъецировали с помощью заточенной иглы в среде CZB-HEPES с добавлением поливинилалкоголя при температуре 22°С. Преимплантационная диагностика синдрома Марфана с помощью ПЦР единичных клеток и рестрикционного анализа Синдром Марфана наследуется по аутосомно-доминантному типу и обусловлен мутациями в гене фибриллина 1. Мутация расположена в 12-м экзоне. Разработан протокол проведения ПЦР с целью выявления данной мутации. Этот тест был опробован на бластомерах, полученных из нежизнеспособных эмбрионов человека. Хромосомный анализ преимплантационных эмбрионов, полученных от фертильных пациентов Использован FISH-анализ для определения пола в случае X-сцепленных заболеваний и проведена преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) хромосомных аномалий, таких, как мозаицизм и транслокации. Исследуемые хромосомные образцы были разделены на 4 группы: нормальные, анормальные (все ядра анормальные), с мозаицизмом (присутствуют две клеточные линии), с хаотическим неконтролируемым делением. Для пациентов, несущих Х-сцепленные заболевания, были проанализированы хромосомы Х, Y и 1. Из проведенных 14 циклов ПГД 48% эмбрионов были нормальными, 24% — с мозаицизмом, 2% — анормальные, 26% — с хаотическим делением. Рассечение зоны пеллюцида для вспомогательного хэтчинга и преимплантационной генетической диагностики (ПГД) Существуют различные методы выполнения вспомогательного хэтчинга. Применен новый подход для получения отверстий в зоне пеллюцида. С помощью простой микроиглы и вращения эмбриона в вертикальной или горизонтальной плоскости создавали х- или v-подобные надрезы на зоне. Этот метод был использован в 87 циклах ПГД или вспомогательного хэтчинга, частота наступления беременности и имплантации составила 42 и 18,2% соответственно. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) перицентрической инверсии 5-й хромосомы У женщины с перицентрической инверсией 5-й хромосомы, 46,ХХ,inv(5)(p14q35), была выполнена ПГД. Ее первому ребенку был поставлен диагноз синдрома “кошачьего крика”, связанного с делецией короткого плеча 5-й хромосомы. Впоследствии было несколько спонтанных абортов. При проведении цикла ЭКО-ПЭ получено 29 ооцитов, из них 18 оплодотворилось, и у 11 полученных эмбрионов произведена биопсия. Используя FISH-метод и зонды для 5р15.2 ( который определял делетированный участок хромосомы, приводящий к появлению синдрома “кошачьего крика”) и для центромерного участка 17-й хромосомы в качестве контроля, было исследовано по 1 — 2 бластомера из каждого эмбриона. Только 2 (18%) из 11 эмбрионов были нормальными по отношению к 5р хромосомы. К тому же лишь 5 эмбрионов имели правильное число контрольных сигналов, что указывает на высокий риск появления многочисленных аберраций на ранних стадиях развития эмбрионов. Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) мутаций в b-глобиновом кластере генов ПГД мутаций в b-глобиновых генах была выполнена в 8 клинических циклах (4 — для серповидно-клеточной анемии и 4 — для IVS1-110, IVS-745 талассемии) с использованием биопсии первого и второго полярного тельца с последующим ПЦР-анализом. Из 111 ооцитов у 63 был проведен последовательный анализ первого и второго полярного тельца. В результате отобран и перенесен 21 здоровый эмбрион (2,6 эмбриона на цикл). Чтобы избежать возможного ошибочного диагноза, связанного с потерей аллеля, одновременно проводилась амплификация двух высокополиморфных маркеров, тесно сцепленных с b-глобиновыми генами. Фрагментация ДНК сперматид, используемых для проведения ИКСИ Показано, что сперматозоиды, используемые для проведения ИКСИ, часто имеют повышенный уровень фрагментированной ДНК, что негативно влияет на частоту оплодотворения. Предварительные результаты показали, что круглые сперматиды имеют частоту фрагментации ДНК 53,9%, это значительно выше, чем данный показатель у зрелых сперматозоидов (14,5%). Случаи хромосомных аномалий морфологически нормальных эмбрионов, полученных от пациенток с плохим прогнозом наступления беременности Проведена преимплантационная генетическая диагностика 183 морфологически нормальных эмбрионов от 32 пациенток (средний возраст 32 ±3,8 года), у которых не было получено имплантации после переноса эмбрионов по крайней мере в 2 циклах. Только 61 (33%) эмбрион имел нормальный кариотип. У 9 пациенток (41 эмбрион) не было выявлено ни одного нормального эмбриона. Высокая частота хромосомных аномалий в эмбрионах, полученных от молодых женщин с повторяющимися неудачными циклами ЭКО-ПЭ, может вести к имплантации. Распространение мозаицизма в эмбрионах человека С помощью FISH-анализа было исследовано 918 эмбрионов. Мозаицизм был обнаружен в 26%, но его частота зависела от стадии развития и морфологических характеристик эмбрионов. У эмбрионов с блоком развития частота мозаицизма составила 37%, тогда как у нормально развивающихся — 25%. При наличии фрагментации или мультиядерных бластомеров частота мозаицизма составила 44%. Развитие эмбрионов до стадии бластоцисты прогнозирует наступление беременности и имплантации после ИКСИ Проведен анализ результатов 83 циклов ИКСИ, в которых было получено по крайней мере 6 эмбрионов. После выполнения переноса эмбрионов (4 эмбриона на перенос) оставшиеся эмбрионы культивировали до бластоцисты. Темпы развития in vitro этих эмбрионов были хорошим прогностическим признаком наступления беременности в цикле. Так, при достижении более 50% эмбрионов стадии бластоцисты на 4 — 5-й день культивирования частота имплантации составила 39,4%, а частота наступления беременности на перенос эмбрионов составила 79,3%. Если ни один из культивируемых эмбрионов не достигал стадии бластоцисты, частота наступления беременности и имплантации составляла 10 и 2,9% соответственно. Эти результаты показывают, что имплантация эмбрионов во многом зависит от их качества и наследственного потенциала. Влияние морфологических характеристик ооцитов на частоту оплодотворения и качество эмбрионов после ИКСИ В общей сложности 1920 ооцитов были получены в 176 циклах ИКСИ и из них 1506 ооцитов находились на стадии MII и были пригодны для изучения. Все исследуемые ооциты были разделены на две группы в зависимости от морфологических показателей. Ооциты с ясной среднегранулированной цитоплазмой, прозрачной бесцветной зоной пеллюцида и маленьким перевиттелиновым пространством были отнесены к норме. Ооциты, не соответствовавшие данным критериям, считались анормальными. Нормальные и анормальные ооциты сравнивали на предмет частоты оплодотворения, темпов дробления и качества получаемых эмбрионов. По всем трем показателям не было выявлено достоверных различий между двумя группами. Таким образом морфологические показатели ооцитов не влияют на исход ИКСИ. Влияние селективного механического хэтчинга на частоту наступления беременности и имплантации после ИКСИ Изучали влияние механического хэтчинга на исход циклов ИКСИ в неблагоприятных группах пациенток: женщины старше 35 лет, женщины с высоким (больше 10мМЕ/мл) базальным уровнем ФСГ, пациентки с отсутствием имплантации в предыдущих попытках и женщины, у которых для ПЭ имелись только эмбрионы плохого качества. Частота наступления беременности на перенос эмбрионов в группе со вспомогательным хэтчингом и в контроле составила 40,5 и 36,6% соответственно. Перевод И. Акуловой |