Цитогенетический анализ ооцитов, полученных у женщин старшей возрастной группы в программе ЭКО
|
Как нами было уже показано, возраст пациенток является одним из ведущих прогностических факторов, определяющих эффективность программы ЭКО [1]. Для изучения изменений, происходящих в ооцитах женщин старшей возрастной группы, мы провели цитогенетическое исследование неоплодотворившихся ооцитов.
Мы проанализировали клинические, эмбриологические и цитогенетические данные пациенток, у которых были получены ооциты, которые в дальнейшем были расценены как неоплодотворившиеся. Все женщины, включенные в исследование, проходили лечение методом ЭКО в нашем центре в 1994—1996 г.г. Для стимуляции яичников назначали кломифенцитрат в дозе 100 мг со 2 по 5 день менструального цикла, препараты чМГ со 2—3 дня цикла в дозе 75—225 мЕд до момента достижения лидирующим фолликулом 18 мм в диаметре, и препарата хорионического гонадотропина — 7500—10000 мЕд в качестве овуляторной дозы. Мы разделили пациенток на 2 группы: в I группу вошли 15 женщин моложе 36 лет, (средний возраст 30,0±4,2 года), во II гр. — 10 женщин старше 36 лет (средний возраст 39,2±3,2 года); разница в возрасте статистически достоверна (p меньше 0,01). Базальный уровень ФСГ на 3 день менструального цикла I группы был 4,9±2,1 мЕд/л, во II группе — 9,1±3,1 (р меньше 0,01). Среднее количество ампул чМГ, необходимых для овариальной стимуляции в I группе было 9,3±1,3 во II группе. 12,7±2,5 (р меньше 0,05 ). Среднее количество ооцитов, полученных при овариальной пункции в I группе составило 7,0±2,6, во II группе—3,6±1,7 (р меньше 0,01). Согласно оценке по состоянию ооцит-кумулюсного комплекса, было получено в I группе—79% зрелых ооцитов, во II группе—69%, незрелых и перезрелых—21 и 38%, соответственно. Среднее число эмбрионов в I группе составило 3,2±1,2, во II—1,1±0,7. Дробления не было у одной пациентки в I группе (6,6%) и у трех пациенток во II группе (30%). В I группе мы получили 3 клинические беременности—21,4% в расчете на перенос эмбрионов, во II группе беременностей не было. Цитогенетическое исследование ооцитов по методу Тарковского было предпринято через 48 часов после пункции фолликулов [2]. Данные цитогенетического исследования представлены в таблице (результаты оценки анеуплоидии, выявленной в обеих группах, которые не отличались между собой, в ней не приведены). Данные, представленные в таблице, были получены весной 1996 г. Выяснилось, что подобный феномен дегенерации ооцитов в старшей возрастной группе отмечен также японскими исследователями, которые сравнили ооциты, полученные при индукции суперовуляции у мышей линии ICR в младшей (7—8 недель) и старшей возрастных группах (40—48 недель). Выяснилось, что среднее количество ооцитов в младшей группе было 23,8±6,8 в старшей — 11,9±4,8, р меньше 0,05; частота оплодотворения составила 56,7 и 29,6% соответственно. При анализе ооцитов с помощью метода детекции обрывков ДНК, специфичных для апоптоза (так называемый Tunel-метод), выяснилось, что после 24 час культивирования специфическая дегенерация генетического материала наблюдалась в 18,8% в младшей группе и 67,5% в старшей группе, что совпадает с нашими данными [3]. Недавно появилась новая работа, в которой были оценены цитогенетические показатели не оплодотворившихся ооцитов в программе ЭКО у женщин различной возрастной группы. Выяснилось, что уровень анеуплоидии не возрастает параллельно увеличению возраста пациенток: 14,8% при возрасте пациенток 24—34 года и 12,4% при возрасте 35—39 лет. При анализе возрастного распределения специфической хромосомной дегенерации в неассоциированных хроматидах выяснилось, что в группе женщин 24—34 лет она составляет 23,7% от исследованных ооцитов, в группе 35—39 лет — 52,0%, а в группе женщин 40—44 лет уже 95,8%. Интересно отметить и клинические данные, полученные у этих пациенток: среднее количество ооцитов 19,6, 16,6, 8,2 соответственно; частота оплодотворения 50,9%, 49,3%, 37,9% соответственно [4]. Данные цитогенетического исследования
Эти данные указывают на незначительное ухудшение качества ооцитов, а также на существование специфических механизмов, вызывающих процессы дегенерации в старшей возрастной группе пациенток. Однако до сих пор неизвестны причины, ведущие к столь значительным изменениям в ооцитах. В предыдущих работах мы попытались осветить некоторые вопросы старения репродуктивной системы женщины и сейчас лишь кратко их напомним. Уже более 30 лет известны факты увеличения частоты хромосомных анеуплоидий у детей, родившихся у матерей старше 35 лет [5]. В 1987 г. Richardson опубликовал работу, в которой было показано, что скорость исчезновения фолликулов в яичнике женщины удваивается после 37 лет [6]. В 1992 году появились данные, что процесс выхода фолликулов из покоящегося примордиального пула полностью зависит от возраста женщины и уменьшается с 50—53 в 20—25 лет, до 3—5 в 40—43 года [7]. Соответственно уменьшаются и возможности отбора наиболее здорового ооцита для овуляции. В литературе существуют две точки зрения на механизмы изменений, происходящих в ооцитах. Согласно первой, изложенной в статье S. Henderson и R. Edwards, качество ооцитов заложено изначально во время внутриутробного развития яичника и фолликулы, первыми вошедшие в мейотическое деление первыми овулируют при установлении репродуктивной функции [8]. Интересно, что в недавней работе американских исследователей было показано, что частота нерасхождений хромосом в ооцитах эмбриональных яичников строго зависит от срока беременности. Так, если частота анеуплоидии в ооцитах на 15—25 неделях беременности составляет для различных хромосом 0—0,3%, то к рождению эта частота повышается до 1,4—4% [9]. Согласно второй теории частота нерасхождений может быть связана с гормональными изменениями, происходящими в репродуктивной системе женщины. Действительно, после 35 лет у женщины постепенно сокращается вероятность зачатия в расчете на один менструальный цикл и продолжительность самого менструального цикла, причем за счет фолликулярной фазы, снижается выработка ингибина B клетками гранулезы фолликулов 2—10 мм в диаметре, что приводит в свою очередь к более раннему и резкому повышению уровня ФСГ в начале фолликулярной фазы цикла и, соответственно, раньше происходит овуляция. Все эти факторы могут играть некую негативную роль в фолликулогенезе, однако прямых доказательств этому пока не получено. В недавней работе С. Friedman и соавт. было показано, что при сравнении уровня васкулярного фактора роста (ВРТ) в фолликулярной жидкости женщин молодого возраста (до 30 лет) и женщин старшей возрастной группы (после 38 лет) выяснилось, что он составляет 2205 пг/мл и 3735 пг/мл соответственно. Авторы делают предположение, что повышенное содержание ВРТ в фолликулярной жидкости женщин старшей возрастной группы может свидетельствовать о недостатке кровоснабжения фолликулов, что может в свою очередь приводить к наблюдаемым изменениям в ооцитах—повышенной частоте дегенерации [10]. В настоящее время становится понятным, что в основе уменьшения способности женщины к зачатию в конце четвертой — начале пятой декады жизни лежат тонкие механизмы, связанные с ухудшением качества ооцитов (специфическая дегенерация—апоптоз) и, возможно, самих фолликулов. Эта группа больных должна привлекать внимание врачей—репродуктологов как в плане разработки специальных схем овариальной стимуляции, так и в плане более тщательного исследования при наступлении беременности, прежде всего ввиду высокой вероятности хромосомной патологии. К.Ю. Боярский, С.Е. Василевская Центр ЭКО при ММУ; женская консультация г. Пушкин , Санкт-Петербург Литература 1. Боярский К.Ю. Старение репродуктивной системы и результативность вспомогательных репродуктивных технологий. Пробл репрод 1966;2:4:57-62. 2. Fuji Y., Ozaki K., Yamamasu S. et al. DNA fragmentation of oocytes in aged mice. Hum Reprod 1996;11:1480—83. 3. Lim A., Tsakok M. Age-related decline in infertility: a link to degenerative oocytes? Fertil Steril 1966;68:265—71. 4. Hassold T., Jacobs P. Trisomy in man. Ann Rev Genet 1984;18:69—77. 5. Richardson S., Senikas V., Nelson J. Follicular depletion during the menopausal transition: evidence for accelerated loss and ultimate exhaustition. Jour Clin Endocr Metab 1987;65: 1231—7. 6. Faddy M., Gosden R. A mathematical model of follicle dynamics in the human ovary. Hum Reprod 1995;10:770—5. 7. Henderson S.,Edwards R. Chiasma frequency and maternal age in mammals. Nature 1968;218:22—8. 8. Cheng S., Cheng Y., Gartler S. A cytological evaluation of the production line hypothesis in human oogenis using chromosome painting. Am Jour Hum Genet 1995;57 (suppl 1): abs 264. 9. Friedman C. et al. Follicular fluid vascular endothelial growth factor concentrations are elevated in women of advanced reproductive age undergoing ovulation induction. Fertil Steril 1997;68:607—12. |