Использование сперматид в процедуре ЭКО/ИКСИ
|
Редакция выражает компании “Органон” признательность за возможность использования сети INTERNET-MEDLINE при подготовке этого обзора.
П.А. Гоголевский Московский центр по лечению бесплодия ЭКО Словарь Сингамия — объединение гаплоидных наборов хромосом женского и мужского пронуклеусов оплодотворенной яйцеклетки. Синдром только клеток Сертоли — форма дизгенеза семенников, характеризующаяся бесплодием в результате недоразвития сперматогенного эпителия половых желез. Синдром Клайнфельтера — обусловлен трисомией по половым хромосомам — XXY. Проявляется в нарушениях сперматогенеза, в недоразвитии вторичных половых признаков и т.д. Синдром Кальмана — ольфактогенитальный синдром, характеризующийся врожденным отсутствием обоняния и задержкой полового развития вследствие поражения обонятельного нерва и комплекса эндокринных расстройств; локус KAL расположен на участке p22.32 X-хромосомы. Спермиогенез — заключительный этап сперматогенеза, в процессе которого происходит формирование сперматозоидов из сперматид. Осцилин (SCF) — растворимый цитозольный фактор (33кД) локализующийся в экваториальном сегменте головки сперматозоида. Инициирует активацию ооцита посредством запуска осциляции ионов Са+. Гистоны — белки содержащиеся в ядрах клеток в виде комплекса с ДНК, выполняют важную функцию в ее упаковке, формируют нуклеосомы — основные структурные субъединицы хроматина. Протамины — низкомолекулярные основные ядерные белки, содержащиеся в сперматозоидах и участвующие в конденсации ДНК сперматозоидах. Введение Метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ) является мощным орудием для лечения бесплодия, обусловленного тяжелыми формами олигоастенотератозооспермии и отсутствием оплодотворения in vitro неясного генеза [25,40,41]. Данный метод также с успехом применяется для достижения оплодотворения и беременности с использованием эпидидимальных и тестикулярных сперматозоидов, полученных у мужчин, страдающих обструктивной формой азооспермии и даже при необструктивных формах азооспермии, обусловленной дефектным сперматогенезом [20, 37,10,29]. Однако, у некоторых мужчин невозможно получить даже единичные сперматозоиды из-за серьезного нарушения сперматогенеза и блока их созревания на стадиях сперматид. Так, например, при синдроме только клеток Сертоли, блоке созревания, евнухоидизме, атрофии канальцев при крипторхизме, синдроме Клайнфельтера и др. шансы обнаружить сперматозоиды в биоптате яичка невелики. Однако теперь и у таких пациентов появилась надежда стать генетическими отцами благодаря интрацитоплазматической инъекции сперматид. В настоящем обзоре приводятся результаты экспериментальных исследований и клинического применения сперматид на разных стадиях дифференцировки (ранних — круглых и поздних — удлиняющихся и удлиненных сперматид) при лечении мужского бесплодия в программе ЭКО. В экспериментах на хомяках и мышах было показано, что круглые сперматиды или изолированные ядра круглых сперматид способны участвовать в сингамии после их введения в зрелые ооциты путем инъекции или электрослияния [22,23]. Потомство было получено после слияния мышиных ооцитов со сперматидами [24]. Успешное оплодотворение было достигнуто после интрацитоплазматической инъекции изолированных ядер круглых сперматид у кроликов [32] и у мышей [15]. Таким образом, первоначальные исследования на животных продемонстрировали возможность достижения оплодотворения и рождения нормального плодовитого потомства после инъекции сперматид в ооциты. Впервые об успешном оплодотворении ооцитов человека после инъекции сперматид, находящихся на поздних стадиях развития, было сообщено Vanderzwalmen [39]. Tesarik с соавт. [35] сообщил о первых двух детях, рожденных после переноса эмбрионов, полученных с помощью ИКСИ с использованием сперматид. Совсем недавно появилось несколько сообщений о наступлении беременности и рождении нормальных детей при использовании круглых и удлиненных сперматид, выделенных из эякулята или яичек [34,35,3,5]. Однако до настоящего времени имеется лишь ограниченное число оригинальных опубликованных работ, посвященных наступлению беременности и рождению детей после использования сперматид [3 — 5,35,12,13,6,19]. Antinori с соавт. [3] выполнили TESE у 36 мужчин, страдающих необструктивной формой азооспермии. Круглые сперматиды (КС) были инъецированы в 135 зрелых ооцитов, полученных от 19 пациентов; удлиненные сперматиды (УС) инъецированы в 123 ооцита в 17 циклах. Процент оплодотворения и частоты дробления составили для КС 55,5% и 74,6%, для УС — 57,7% и 77,4%, соответственно. Было получено 5 беременностей (2 в группе КС — 10,5% и 3 в группе УС — 17,6%). Кариотипирование плодов не выявило каких-либо генетических аномалий. В работе Fishel S. с соавт. [12] сравнивали частоту оплодотворения после инъекции сперматид, полученных из эякулята и биоптата яичка. Всего было инъецировано 207 зрелых ооцитов, из них 64 КС, 92 УС и 51 сперматозоидами. Частота оплодотворения составила 30%, 24% и 67% соответственно. Наблюдалось значительное увеличение частоты оплодотворения (р меньше 0,001) при использовании сперматозоидов по сравнению со сперматидами. Частота оплодотворения практически не различалась при использовании круглых или удлиненных сперматид, хотя при инъекции КС и УС, полученных из эякулята, частота оплодотворения составила 33% и 18%, тогда как при использовании тестикулярных сперматид данные показатели составили 22% и 38% соответственно. У трех пациентов на ооцитах-сибсах сравнили эффективность ИКСИ сперматидами, полученными из эякулята со сперматозоидами, извлеченными из семявыносящих канальцев. Общая частота оплодотворения после инъекции сперматид была значительно ниже 26,3%, чем после ИКСИ тестикулярными сперматозоидами (66,7%). Не было выявлено значительного различия в частоте оплодотворения при использовании сперматид из эякулята или тестикулов. Влияние криоконсервации на целостность и оплодотворяющие способности КС были изучены у двух пациентов, страдающих азооспермией, обусловленной блоком созревания сперматогенеза [3]. После проведения биопсии яичка были обнаружены только КС, которые и использовались для инъекции и криоконсервации. Из-за отсутствия имплантации в первых попытках у обеих пациенток во втором цикле проводили ИКСИ замороженными-оттаянными сперматидами. После оттаивания более 70% сперматид были пригодны для инъекции. Из 15 инъецированных ооцитов 7 показали нормальное оплодотворение и 6 нормальное дробление. После ПЭ у одной пациентки наступила беременность. В следующей работе этих авторов [4] было инъецировано замороженными-оттаянными сперматидами 48 ооцитов, полученных от 7 пациенток. 26 (54%) ооцитов нормально оплодотворилось и 19 (73%) зигот подробилось. Получено две беременности после 6 ПЭ. Хромосомный анализ, выполненный на 16 неделе беременности, выявил нормальный кариотип всех плодов. Представленные данные говорят о том, что замороженные-оттаянные круглые сперматиды сохраняют свою оплодотворяющую способность и могут быть использованы в последующих циклах для проведения ИКСИ. Antinori S. с соавт. [4,5] провели рандомизированное исследование, в котором сравнили оплодотворение, дальнейшее развитие эмбрионов и наступление беременности после инъекции круглых и удлиненных сперматид. Всего 211 зрелых ооцитов, полученных в 29 циклах, были инъецированы круглыми сперматидами ( группа А) и 229 ооцитов в 39 циклах инъецированы удлиненными сперматидами (группа В). Частота оплодотворения, дробления и наступления беременности в группе А составила 55,4%, 69,5% и 13,7%, а в группе В — 69%, 75,3% и 20,5% соответственно. Эти данные говорят, что оплодотворяющий потенциал УС значительно выше КС. Chen S.U. с соавт. [9] провели инъекцию сперматид в 13 ооцитов, полученных от одной пациентки. Четыре ооцита нормально оплодотворились и по одному ооциту имели 3 и 1 пронуклеусы. На 2 день был выполнен ПЭ. Беременность не наступила. Schoysman R. с соавт. [28] сообщили о результатах инъекции круглых и поздних сперматид. В первой группе мужчин с предварительной положительной тестикулярной биопсией (обнаружены сперматозоиды) было проведено 2 попытки с помощью инъекции поздними сперматидами (ПС) и 10 с КС. В другой группе из 5 пациентов (блок созревания, очень высокий уровень ФСГ) с предварительной негативной биопсией небольшое количество КС было обнаружено только в 3 случаях. Процент оплодотворения в 1 группе составил 100% (4/4) после инъекции ПС. После инъекции КС он достиг 26% (10/32) без искусственной активации и 33% (4/12) и 64% (7/11) после обработки ооцитов манитолом и кальцием ионофором соответственно. В группе с предварительной негативной биопсией процент оплодотворения составил только 14%. Из 28 зигот 25 нормально подробилось. После выполнения ПЭ было получено две беременности (одна после инъекции ПС и одна после КС). В работе Vanderzwalmen P. с соавт. [38] зрелые, удлиненные, удлиняющиеся и круглые сперматиды были использованы для инъекции соответственно в 3, 2, 3 и 32 попытках). С помощью КС было инъецировано в общей сложности 260 ооцитов и 36 ооцитов инъецировано сперматидами других стадий.Частота оплодотворения после инъекции КС зависела от процента сперматозоидов, обнаруженных во время предварительной диагностической биопсии яичка. Пациенты с позитивными результатами предварительной биопсии имели значительно выше процент оплодотворения (33%) по сравнению с пациентами, у которых полностью отсутствовали сперматозоиды (11% р меньше 0,05). Инкубация ооцитов в среде, содержащей кальций ионофор, после инъекции КС позитивно влияло на оплодотворение (36% против 16 % в контроле). 90% из всех нормально оплодотворившихся ооцитов подробились и процент эмбрионов класса А и В зависел от стадии зрелости сперматид ( 12% для КС и 30% для остальных стадий). Наступило пять беременностей после 39 ПЭ. Частота имплантации составила 5,5%, что значительно ниже таковой в обычной программе ИКСИ/ТЕSЕ с использованием тестикулярных сперматозоидов (10,5%). В случаях абсолютной азооспермии, подтвержденной несколькими повторными исследованиями центрифугированного эякулята, возможен незначительный локальный сперматогенез в яичках. И даже когда тестикулярная диагностическая биопсия выявляет полное отсутствие сперматогенеза, существует вероятность, что в некоторых участках могут продуцироваться единичные сперматозоиды или их предшественники. Так у 14 мужчин, страдающих секреторной формой азооспермии, обусловленной блоком созревания или синдромом только клеток Сертоли, у которых в предварительных диагностических биопсиях не было выявлено сперматогенеза, была проведена попытка извлечения спермы с помощью TESA [30]. В 13 из 14 случаев были извлечены сперматозоиды и/или зрелые сперматиды в количестве, достаточном для проведения ИКСИ. В работе Levran D. с соавт. [18] с помощью открытой тестикулярной биопсии были получены сперматиды в 9 циклах у 5 пациентов. Процент клеток, лизировавших после инъекции, составил 9,5%. Частота оплодотворения и дробления составили 58% (49/84) и 43% (28/49) соответственно. Однако качество эмбрионов было довольно низким и 86% из них имело более 30% фрагментации. В общей сложности было перенесено 28 эмбрионов, что в среднем составило 3,5±1,5 на ПЭ. Беременность не наступила ни в одном из случаев. Полученные результаты выявили приемлемую частоту оплодотворения с использованием КС, однако был показан довольно высокий процент блока дробления и низкое качество получаемых эмбрионов. У 23 из 75 (30,7%) пациентов, страдающих необструктивной азооспермией, смогли получить сперматиды [1]. Причем в 15 случаях удалось получить круглые сперматиды и оставшихся 8 — удлиненные. Оплодотворение наступило в 62 инъецированных ооцитах (41%) и дробление произошло в 53 оплодотворенных ооцитах (85%). ПЭ имел место в 16 циклах (69,5%). Беременность не наступила ни в одном случае. Lee D. R. с соавт. [17] выполнили работу для того, чтобы оценить присутствие КС и сперматозоидов в тестикулах пациентов, страдающих необструктивной формой азооспермии. Тестикулярная ткань была получена от 52 мужчин с помощью множественной тестикулярной биопсии. У пациентов с гипосперматогенезом (13) КС наблюдали во всех случаях и сперматозоиды в 9 случаях, КС и сперматозоиды были обнаружены в 13 и 6 случаях при блоке созревания (17) и 15 и 5 случаях при синдроме только клеток Сертоли (22) соответственно. Применение КС для инъекции в цитоплазму ооцитов привело к меньшей частоте оплодотворения и наступления беременности по сравнению с ИКСИ нормальными тестикулярными сперматозоидами. During S.A. с соавт. [11] использовали КС от пациентов, страдающих необструктивной формой азооспермии, и получили 31% оплодотворения. После выполненных ПЭ наступило 2 беременности. В работе Tanaka A. с соавт. [33] в программу по изучению инъекции КС в ооциты было включено 15 мужчин, страдающих секреторной формой азооспермии с блоком сперматогенеза на стадии круглых сперматид и высоким уровнем ФСГ (>20 mlU/ml). Для активации ооцитов за 60—120 мин до инъекции использовали электрические импульсы. В общей сложности оплодотворилось 62% ооцитов (95 из 153) и из них 64 (67%) имели 2 пронуклеуса. Одна наступившая беременность закончилась абортом. В другой работе Tanaka A. с соавт. [34] изучали влияния электрической и механической стимуляции (ЭС и МС) на оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов после инъекции круглых сперматид. Частота нормального оплодотворения, дробления и развития эмбрионов до стадии бластоцисты составила 66,1%, 77,6%, 17,6% при ЭС и 50%, 67% и 16,7% соответственно при МС. Было показано, что после 48 часов культивирования in vitro у 22,2% круглых сперматид начинает формироваться хвостик и что инъекция таких сперматид более эффективна, чем инъекция КС даже с применением электрических или механических стимуляторов и приводит к 82,4% нормального оплодотворения и 35,7% развития полученных эмбрионов до стадии бластоцисты. Kanraman S. с соавт. [14] провели лечение 23 мужчин, страдающих необструктивной формой азооспермии, у которых с помощью открытой биопсии были получены пробы тестикулярной ткани. В 20 случаях в пробах были обнаружены только КС и также в 3 случаях обнаружены удлиненные сперматиды. Частота оплодотворения и дробления после инъекции КС и УС составила 26,1%, 15,1% и 70,9%, 51,6% соответственно. Всего было выполнено 19 ПЭ (43 эмбриона) и получено три беременности (15,7% на ПЭ). Одна беременность, полученная с КС, закончилась абортом. Оставшиеся две, полученные с УС, были дву- и трехплодными. Трехплодная беременность закончилась абортом в первом триместре, а двухплодная — рождением нормальных детей. Более высокая частота оплодотворения с помощью удлиненных и удлиняющихся сперматид была получена, что говорит о влиянии на исход ИКСИ используемой стадии сперматид. При использовании КС наблюдали больший процент анормального оплодотворения, темпы дробления были медленнее и качество получаемых эмбрионов хуже. Mansour R.T. с соавт. [19] получили 41% оплодотворения после инъекции сперматид в ооциты и наступление беременности в 1 случае (9%) после ПЭ. В работе Araki Y. с соавт. [6] 36 мужчин с азооспермией проходили тестикулярную биопсию и у 9 пациентов были получены только сперматиды, которые были использованы для проведения ИКСИ. Были получены три беременности, закончившиеся рождением здоровых детей. Prapas c соавт. [27] провели 8 лечебных циклов с использованием сперматид. Частота оплодотворения и дробления составила 38% и 84% соответственно. Было получено две беременности. Barak Y. [8] описывает случай наступления беременности после переноса однопронуклеарных эмбрионов. В данной работе удлиненные сперматиды были инъецированы в 137 ооцитов, полученных в 13 циклах, и 37 ооцитах в 13 циклах инъецированы КС. Частота нормального оплодотворения составила 35,8% для УС и 27% для КС. Частота формирования однопронуклеарных ооцитов составила 17,5% для УС и 35% для КС. Была получена одна прогрессирующая беременность. Обсуждение Таким образом, ранние (круглые) или поздние (удлиненные, удлиняющиеся и зрелые) сперматиды, полученные из эякулята или тестикулярной ткани, могут быть использованы для проведения цитоплазматической инъекции. Однако частота наступления беременности после инъекции сперматид остается очень низкой. И, хотя инъекция круглых и поздних сперматид в ооциты может индуцировать оплодотворение, развитие эмбрионов, наступление беременности и рождение нормальных детей, большое количество вопросов остается до конца невыясненными. В настоящее время нет единого мнения какой источник получения сперматид предпочтительней — эякулят или тестикулярная ткань. Одним из важных аспектов использования сперматид для инъекции в ооциты является тип инъецированных клеток (КС или УС). Было показано преимущество использования УС по сравнению с КС. Это может быть объяснено следующими факторами:1) транскрипция некоторых генов, которая имеет место в КС завершается на стадии поздних сперматид, 2) морфологически данные клетки легче идентифицировать, 3) возможно, что содержащийся в УС фактор/факторы более компетентен для активации ооцитов. Спермиогенез — процесс при котором круглые сперматиды трансформируются морфологически и биохимически в удлиненные тестикулярные сперматозоиды. Сперматиды формируются после мейотического деления вторичных сперматоцитов и они, как и сперматозоиды, содержат гаплоидный набор хромосом (1нДНК). Главные события во время спермиогенеза состоят из конденсации и изменения формы ядра, развитие акросомы и реорганизации и уменьшения цитоплазмы. Более детальное изучение следует посвятить зрелости ДНК и конденсации хроматина. Показано, что во время спермиогенеза гаплоидные ядра сперматид крысы имеют широко диспергированный хроматин с небольшим скоплением гетерохроматиновых участков ядрышек. Такой диспергированный хроматин во время спермиогенеза проходит конденсацию, в котором различают два главных события. В первом происходит замена нескольких тестисспецифических гистонов, присутствующих в сперматоцитах и КС, основными протеинами сперматид. Это процесс постепенно происходит во время изменения формы ядра и конденсации хромосом. Во втором основные белки сперматид замещаются протаминами богатыми аргинином и цистеином. Ассоциация этих протеинов с ядерной ДНК обеспечивает конденсацию и стабилизацию хроматина. Процесс замещения гистонов протаминами происходит в начале стадии удлиненных сперматид. Было также показано, что протамины синтезируются до конца спермиогенеза и что хроматин мужских гамет в середине процесса спермиогенеза претерпевает изменение, когда в ядрах сперматид прекращается транскрипция. Эта пауза в РНК синтезе завершается после оплодотворения, когда протамины мужского пронуклеуса будут замещены гистонами ооцита. Эти данные могут в какой-то мере объяснить более высокую частоту оплодотворения с удлиненными сперматидами, чем с круглыми. Одним из критических моментов выполнения данной процедуры является точная идентификация различных клеток, особенно КС. И хотя некоторыми группами получены удовлетворительные результаты в плане частоты оплодотворения, используя обычный инвертированный микроскоп, Miyagawa с соавт. [21] рекомендуют использовать для этих целей кофокальный сканирующий лазерный микроскоп или микроскоп, укомплектованный компьютерной системой. Ряд работ посвящен правильной идентификации КС в эякуляте или тестикулярных образцах [2]. Zavos M. с соавт. [43] разработали метод с использованием градиента Перколла для отделения КС в образцах эякулята мужчин, страдающих необструктивной формой азооспермии. Вращательное движение сперматид говорит о том, что данные клетки живые и их использование для инъекции предпочтительней, чем неподвижных сперматозоидов [9]. При выявлении подвижных сперматозоидов в образце их следует использовать в первую очередь. При выполнении ИКСИ сперматозоиды ответственны за активацию ооцитов путем увеличения внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция. Этот эффект опосредован специфическим цитозольным фактором сперматозоида (SCF, осцилин), который выделяется в цитоплазму ооцита [13,35]. Avrech O.M. с соавт. [7] изучили влияние введения SCF в неоплодотворенные ооциты на активацию и эмбриональное развитие. Было показано, что инъекция SCF в неоплодотворившиеся после ИКСИ и КС инъекции ооциты индуцирует активацию с последующим дроблением зигот. Микроинъекция SCF вместе с неподвижными сперматозоидами или с изолированными ядрами КС повышает частоту оплодотворения мышиных ооцитов [16]. Последние исследования показали, что как КС, так и УС содержат спермальный растворимый фактор. Однако активность осцилина сперматид требует активатора для запуска осцилляции ионов Са+, и этим активатором может быть аспирация ооплазмы во время проведения процедуры ИКСИ, добавления Са-ионофора в культуральную среду после инъекции или электростимуляция.Также показано, что SCF активность во время сперматогенеза появляется на стадии между вторичными сперматоцитами и круглыми сперматидами. Показанием для использования сперматид для оплодотворения с помощью ИКСИ могут быть также случаи необъяснимого отсутствия сперматозоидов в эякуляте или тестикулярном аспирате в день пункции, несмотря на то, что в предварительном исследовании были обнаружены сперматозоиды. Именно у таких пациентов были получены три первые беременности [12, 13, 34, 35]. Избежать этого можно с помощью криоконсервации сперматозоидов, полученных при диагностических тестикулярных биопсиях. Интересным оказалось, что приемлемая частота оплодотворения была достигнута после инъекции сперматид, полученных у пациентов с положительной предварительной биопсией. Эти результаты были получены как в ОА группе, так и в НОА [39]. Низкий процент оплодотворения и высокая частота блока развития эмбрионов отражает низкий потенциал КС, полученных из патологических яичек (негативная предварительная диагностическая биопсия) инициировать нормальное оплодотворение и последующее дробление ооцитов. Не совсем ясно, каким образом это оказывает такой эффект на исход инъекции. Возможно, что сперматиды, полученные из очень патологических яичек, не полностью идентичны сперматидам извлеченных из яичек имеющих фокально сохранившийся сперматогенез. Вероятно, что потенциал сперматид, полученных у мужчин с предварительной положительной биопсией, выше в плане частоты оплодотворения и дробления по сравнению с тем же типом клеток, полученных при негативной биопсии. Это может быть объяснено деконденсированным состоянием хромосом сперматид, особенно КС. Таким образом, ДНК-мутации могут происходить в таком нестабильном состоянии, что объясняет низкую частоту имплантации [38,39]. Многие авторы утверждают, что супружеские пары, вовлеченные в программу с использованием сперматид, так же как и в обычную программу ИКСИ, должны быть проверены на генетические аномалии. Мужчины, страдающие бесплодием, имеют в среднем 10-кратное увеличение общих соматических хромосомных аномалий и повышенный уровень аномалий и дисомий в сперматозоидах. Высокая частота (12,32%) микроделеций Y хромосомы была выявлена у мужчин с необструктивной идиопатической азооспермией [42]. Silber S. с соавт. [31] показал, что 13% мужчин, страдающих азооспермией, имеют делеции DAZ кластера Y-хромосомы. Для установления диагноза мужского бесплодия необходимо также проводить анализ делеций AZF региона. Актуальное значение приобретает преимплантационная генетическая диагностика, а также тщательный мониторинг всех детей, рожденных после применения данного метода. О необходимости глубоких и тщательных исследований в области использования сперматид для лечения бесплодия свидетельствует и тот факт, что в настоящее время японское общество по бесплодию (JSFS) ввело мораторий на их применение по следующим причинам: 1. Проведено недостаточное количество экспериментов на животных, демонстрирующих полную безопасность данного метода, 2. Существует вероятность, что КС могут быть неправильно идентифицированы и для ИКСИ ошибочно использованы другие круглые клетки. 3. Недостаточно всесторонне изучена частота хромосомных аномалий у мужчин, страдающих азооспермией, и у которых планируется использование ИКСИ сперматидами. 4. Неотработаны оптимальные условия для электрической активации ооцитов. Всего лишь несколько лет назад многим мужчинам, страдающим азооспермией, обусловленной серьезной дисфункцией яичек, невозможно было помочь с помощью ВРТ. Совершенно очевидно, что большая экспериментальная и клиническая работа должна быть проведена прежде, чем цитоплазматическая инъекция сперматид станет эффективным методом для лечения необструктивной азооспермии. И можно надеяться, что в недалеком будущем эффективность данного метода может быть существенно повышена [21]. Литература 1. Abaas S.A. et al. Experience with intracytoplasmic spermatid injection in the treatment of non obstructive azoospermia. 10th World Congress on IVF and AR. 1997;609 — 613. 2. Angelopoulos T. et al. Occurrence and Identification of Round Spermatids in Ejaculates and Testicular Biopsies of Azoospermic Men. ASRM Abstracts. 3. Antinori S. Successful fertilization and pregnancy after injection of frozen-thawed round spermatids into human oocytes. Hum Reprod 1997;12:3. 4. Antinori S. et al. The use of round or elongated spermatids for ICSI: which is more effective? 10th World Congress on IVF and AR. 1997; 547 — 551. 5. Antinori S. et al. Fertilization with Human Testicular Spermatids: Four Successful Pregnancies. Hum Reprod 1997;12:2:286 — 291. 6. Araki Y. et al. Intracytoplasmic injection with late spermatids: a successful procedure in achieving childbirth for couples in which the male partner suffers from azoospermia due to deficient spermatogenesis. Fertil Steril 1997;67:3:559 — 561. 7. Avrech O.M. et al. Sperm cytisolic factor overcomes activation failure of human oocytes injected with spermatozoa and spermatids. ASRM Abstracts. 8. Barak Y. Pandora’s box? Alpha.1997;10. 9. Chen S.U. et al. Fertilization and embryo cleavage after intracytoplasmic spermatid injection in an obstructive azoospermic patient with defective spermiogenesis. Fert Steril 1996;66:1. 10. Devroy P. et al. Pregnancies after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1995;10:6. 11. During S.A. Application of Ooplasmic Round Spermatid Nuclear Injections (ROSNI) for the Treatment of Azoospermic Men in U. ASRM Abstracts.1995. 12. Fishel S. Human fertilization with round and elongated spermatids. Hum Reprod 1997;12:2. 13. Fishel S. Spermatid conception: a stage too early, or a time too soon? Hum Reprod 1996;11:7. 14. Kanraman S. et al. Multiple pregnancies obtained by testicular spermatid injection in combination with intracytoplasmic sperm injection. 10th World Congress on IVF and AR.1997;511 — 515. 15. Kimura Y. et al. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring. Development.1995;121:2397 — 2405. 16. Lacham-Kaplan O. et al. Activation of mouse oocytes with human sperm extract increases fertilization rates after injection of immotile mature sperm and nuclei isolated from round spermatids. ASRM Abstract.1996. 17. Lee D. R. et al. Application of ICSI and ROSI by testicular biopsy in non-obstructive azoospermia. ASRM Abstracts. 18. Levran D. Results of Round Spermatids Injection (ROSI) for Treatment of Defective Spermiogenesis. ASRM Abstracts. 19. Mansour R.T. et al. Intracytoplasmic injection of spermatozoa or spermatids in non-obstructive azoospermia. ASRM Abstracts. 20. Mansour R.T. et al. Intracytoplasmic sperm injection in obstructive and non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1997;12:9. 21. Miyagawa M.D. et al. Update on ROSNI and ROSI. 1996. 22. Ogura A. et al. Behavior of hamster and mouse round spermatid nuclei incorporated into mature oocytes by electrofusion. Zygote. 1993;1:1 — 8. 23. Ogura A. et al. Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes form pronuclei and participate in singamy. Biology of Reproduction. 1993;48:219 — 225. 24. Ogura A. et al. Birth of normal young after electrofusion of mouse oocytes with round spermatid. Proc Natl Acad USA.1994;91:7460 — 7462. 25. Palermo G.D. et al. Intracytoplasmic sperm injection: a powerful tool to overcome fertilization failure. Fert Steril 1996;65:5. 26. Palermo G.D. et al. Human sperm cytosolic factor triggers Ca2+ oscillations and overcomes activation failure of mammalian oocytes. Hum Reprod 1997;3 (4). 27. Prapas Y. et al. Retrieval of spermatozoa and spermatids from testicular tissue in non-obstructive azoospermic patients. O-224. ESHRE.1997. 28. Schoysman R. et al. Results of spermatid injection in human oocytes in relation to previous testis biopsy and oocytes treatment. ASRM Abstracts. 29. Silber S. et al. The use epididimal and testicular spermatozoa for intracytoplasmic sperm injection: the genetic implications for male infertility. Hum Reprod 1995;10:2031 — 2043. 30. Silber S. et al. Successful Pregnancy in Humans Using Testicular Spermatid Extraction (TESE) and ICSI for Azoospermia Due to Sertoli Cell Only and Maturation Arrest. ASRM Abstract. 31. Silber S. et al. Y chromosome deletions in azoospermic and oligospermic men undergoing testicular sperm extraction and ICSI. O-015. ESHRE. 1997. 32. Tanaka A. et al. Clinical Evaluation of Round Spermatid Injection (ROSI) Into Human Oocytes. ASRM Abstracts. 1996. 33. Tanaka A. et al. Comparative study of embryonic development of human oocytes injected with fresh round spermatid and injected with in vitro cultured round spermatid with flagella. 10th World Congress on IVF and AR. 1997; 705 — 710. 34. Tesaric J. et al. Viable embryos from injection of round spermatid into oocytes. N Engl J Med 1995;333 — 525. 35. Tesarik J. Use of immature sperm and sperm precursor cells for fertilization. 10th World Congress on IVF and AR. 1997;661 — 667. 36. Tournaye H. et al. Microsurgical epididimal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection: a new effective approach to infertility as a results of congenital bilateral of the vas deferens. Fert Steril 1994;61:1045 — 1051. 37. Tournaye H. et al. Correlation between testicular histology and outcome after intracytoplasmic sperm injection using testicular spermatozoa. Hum Reprod 1996;11:1. 38. Vanderzwalmen P. et al. Fertilization of an oocyte microinseminated with a spermatid in an in vitro fertilization programme. Hum Reprod 1995;10:502. 39. Vanderzwalmen P. Intracytoplasmic injection of spermatids retrieved from testicular tissue: influence of testicular pathology, type of selected spermatids and oocyte activation. Hum Reprod 1997;12:6. 40. Van Steirteghem A. et al. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1993;8:1061 — 1066. 41. Van Steirteghem A. et al. Higher success rate by intracytoplasmic sperm injection than by subzonal insemination. Hum Reprod 1993;8:1055 — 1061. 42. Yoon H.S. et al. The incidence of Y chromosome microdeletions and the frequency of AZFa, b, c deletions in male infertility patients. ASRM Abstracts. 43. Zavos M. Methods for isolation and purification of post-ejaculate human round spermatids for possible use in intracytoplasmic round spermatid injection (ROSI). ASRM Abstracts. |