Клонирование (обзор литературы)
|
Словарь
Клон — совокупность клеток или организмов, генетически идентичных одной родоначальной клетке. Клонирование (в данном тексте) — метод создания клонов путем переноса генетического материала из одной (донорской) клетки в энуклиированную яйцеклетку. По всей видимости, следует различать перенос ядра эмбриональной клетки и перенос ядра соматической клетки взрослого организма. Энуклеация — методы, включающие полное удаление ядерного материала из яйцеклетки. Импринтинг — зависимость экспрессивности гена от того, каким родителем он передан. Одним из механизмов импринтинга является изменение уровня метилирования ДНК. Тотипотентность — свойство клетки реализовывать генетическую информацию ядра, обеспечивающую развитие до целостного организма. Тотипотентная клетка способна дифференцироваться в любую ткань или специализированную клетку. Митохондриальный геном — кольцевая ДНК около 16,5 тыс. пар нуклеотидов, содержащаяся в цитоплазматических органелах — митохондриях. Общее количество митохондриальной ДНК по сравнению с ядерной менее 1%. Как правило, наследуется по материнскому типу. Трансгенные животные — животные, несущие в своем геноме стабильно интегрированную рекомбинантную генную конструкцию (трансген). В последнее время, после сообщения британских ученых о появлении на свет овцы, генетически идентичной другому животному, но не являющейся ему однояйцовым близнецом и существенно отличающейся от него по возрасту, во всем мире начались оживленные дебаты, касающиеся различных аспектов клонирования млекопитающих. Особенно остро дискутируется эта тема в связи с существующей (пока что, правда, теоретически) возможностью клонирования человека. Средствами массовой информации обсуждаются этические, юридические, религиозные, психологические и другие (порой самые невероятные) проблемы, которые могут возникнуть при внедрении в практику такого способа воспроизводства человека. Не остались в стороне от решения вопроса: «Вы за клонирование или нет?» и российская печать и телевидение. Однако, как можно судить по высказываниям ведущих телевизионных программ, авторов публикаций и других участвующих в препарировании этого сенсационного материала, складывается впечатление о недостаточно глубоком знании и понимании как самой сущности метода клонирования, так и, следовательно, последствий его возможного использования в будущем. В то же время серьезность поставленного вопроса не вызывает сомнений. Поэтому, учитывая уникальность журнала «Проблемы репродукции» в смысле тематики публикаций, достаточно широкий круг его подписчиков, которыми помимо специалистов-репродуктологов, являются и врачи других специальностей, а также желание поделиться данными, почерпнутыми в зарубежной литературе, мы сочли небезынтересным для читателя представить на этих страницах некоторые сведения о клонировании животных. Сначала хотелось бы привести общеизвестный пример естественного клонирования, существующего в природе, имеющего место и у человека — однояйцовые близнецы, развившиеся из одной яйцеклетки. Это всегда только оба мальчика или обе девочки и всегда удивительно похожие друг на друга. Известно также, что эмбрион млекопитающего (в том числе и человека) на самых ранних стадиях (у человека по крайней мере до стадии 8 бластомеров) может быть без видимых отрицательных последствий разделен на отдельные бластомеры, из которых при определенных условиях могут развиться идентичные по своему генотипу особи, по аналогии с однояйцовыми близнецами. То есть из одного 8-клеточного эмбриона у человека можно получить до 8 абсолютно идентичных девочек или мальчиков. Однако, что они будут представлять собой, когда родятся и вырастут? Это вопрос! Скорее всего они будут мало различаться внешне, но условия внутриутробного развития, воспитания, внешней среды, конечно, наложат определенный отпечаток. В практике, основанной на оплодотворении in vitro, культивировании и переносе эмбрионов в матку (хотя это и представляет какой-то интерес), разделение эмбриона на бластомеры и их выращивание у человека не получили признания, с одной стороны, из-за отсутствия в этом необходимости, а с другой — из-за сложности самой процедуры. Следует отметить, что приведенные примеры, несмотря на то, что могут соответствовать понятию «клон», не отвечают термину «клонирование» (см. словарь). Введение Шестьдесят лет назад немецкий эмбриолог, лауреат Нобелевской премии Ганс Шпеман (Spemann) впервые поставил вопрос о целостности и идентичности генома в течение всей жизни организма. Он же предложил эксперимент по переносу ядра какой-нибудь дифференцированной клетки в яйцеклетку с предварительно разрушенным собственным ядром. Совместно с Дришем (Driesch) он впервые показал, что ядра ранних эмбрионов морских ежей и тритонов тотипотентны, т.е. способны обеспечивать развитие любых типов клеток. Естественно встал вопрос, действительно ли рост, развитие и дифференциация эмбриона затрагивают необратимые модификации генома в соматических клетках. Ниже приведены некоторые сведения об экспериментальном клонировании животных, отраженные в литературе. Так, эксперименты, начатые в 1952 г. и проведенные на амфибиях, показали, что из ядер, полученных из клеток ранних эмбрионов, можно клонировать взрослый организм. Однако ядра клеток взрослого животного могли развиваться только до стадии головастика и не могли создавать взрослого клона [2,7,8]. Пересадка ядер у млекопитающих впервые была предпринята на мышах в 1983 г. Более 90% реконструированных зигот мыши, получивших пронуклеусы от других зигот, успешно достигали стадии бластоцисты. Однако когда переносили ядра из 4-, 8-клеточных эмбрионов или ядра внутренней клеточной массы в энуклиированные яйцеклетки, ни одна зигота не достигала стадии бластоцисты [5,9,17]. Опыты по клонированию других видов млекопитающих методом переноса ядер эмбриональных клеток имели определенный успех, и были получены клоны овцы, коровы, кролика, свиньи, козы [1,10,16,21]. Причем первые клонированные овцы родились после переноса ядер 8—16-клеточных эмбрионов [20]. Потомство у коров и овец было получено также после переноса ядер тотипотентных клеток короткоживущей клеточной культуры, полученной из ранних преимплантационных эмбрионов [13,14]. Перенос ядер эмбриональных клеток можно осуществлять между близкородственными видами, например между M.musculus и M.caroli [14-a]. В то же время на последней ежегодной встрече 1997 г. Международного общества по переносу эмбрионов (International Embryo Transfer Society) в Бостоне исследователи из Университета Висконсия-Мадисон сообщили об успешном клонировании 70 эмбрионов при использовании энуклиированных яйцеклеток коров и ядер от эмбриональных клеток овец, свиней, крыс и обезьян. Реконструированные эмбрионы культивировали до 60—120-клеточной стадии. Однако не было получено ни одной беременности после переноса эмбрионов. В 1997 г. Рослинский институт совместно с биотехнологической компанией PPL Therapeutics объявили о клонировании 5 овец с помощью переноса ядер клеток фибробластов плода, в которые предварительно были введены искусственно созданные генетические конструкции. Две полученные таким образом трансгенные овцы несли ген фактора свертываемости крови IX человека. Предполагается, что данный высокоценный белок будет экспрессироваться с молоком овец. Таким образом, интеграция чужеродной ДНК в геном фибробластов не нарушила «генетическую инструкцию», которая контролирует эмбриональное развитие овец [4, 11, 12]. Оригонский региональный исследовательский центр по изучению приматов сообщил о клонировании двух обезьян при использовании ядер клеток эмбриона на стадии дифференцировки [3]. Американская биотехнологическая компания ABS Global Inc. сообщила о рождении в феврале 1997 г. бычка, полученного с помощью технологии клонирования и с использованием ядер первичных стволовых клеток 30-дневного эмбриона [18]. Все приведенные выше работы были выполнены с помощью переноса ядер эмбриональных недифференцированных или частично дифференцированных клеток плодов и эмбрионов и считалось, что получить клон с использованием ядра полностью дифференцированной клетки взрослого организма невозможно. Та самая Долли Наибольший резонанс общественности, в том числе и научной, вызвала работа Уилмута (Wilmut) с коллегами, появившаяся в февральском номере Nature за 1997 г. Это единственная на сегодняшний день опубликованная научная статья, посвященная получению живого потомства после переноса ядра, взятого из соматической клетки взрослого животного. Вкратце результаты этой работы таковы. Были получены три новые клеточные популяции из клеток 9-дневных преимплантационых эмбрионов, 26-дневных плодов и клеток молочной железы 6-летней овцы. Ядра из данных клеток переносили в предварительно энуклиированные неоплодотворенные ооциты овцы. С помощью электропорации стимулировали слияние кариопласта с цитоплазмой и активацию ооцита. Реконструированные таким образом ооциты культивировали in vivo до стадии морула/бластоциста и переносили суррогатным овцам — реципиентам. Из 834 удачно реконструированных ооцитов было получено 8 живых ягнят, причем из 277 ооцитов, в которые переносили ядра клеток взрослого животного, получена только одна — знаменитая Долли [19]. Развитие эмбрионов, созданных путем переноса ядер, в первую очередь зависит от сохранения плоидии реконструированного эмбриона и создания условий, необходимых для нормальной регуляции экспрессии генов во времени и пространстве. Основополагающим фактором, по всей видимости, является стадия клеточного цикла донора и реципиента и взаимодействие между ними. Так, если ядра клеток, находящихся на стадии S или G2, переносят в ооциты, находящиеся на стадии МII, они имеют тенденцию проходить дополнительную ДНК-репликацию и преждевременную конденсацию хромосом, что ведет к анеуплоидии и аномальному развитию реконструированного ооцита [6]. Уилмут преодолел эту проблему с помощью трансплантации ядер из клеток, которые были блокированы на стадии G0 диплоидной фазы путем истощения содержания сыворотки в культуральной среде. Перенос ядер на этой стадии лучше «согласовывался» с цитоплазмой ооцита, уменьшая случаи хромосомных аномалий. Этим можно объяснить существующие трудности в клонировании мышей: ядра эмбриональных клеток в ранней преимплантационной стадии в основном находятся в S и G2, и очень трудно (или почти невозможно) блокировать эмбриональные стволовые клетки на стадии G0 путем истощения сыворотки. Другими факторами, которые могли влиять на успешный исход работы Уилмута, являются 1) большая доступность хроматина (за счет деспирализации ДНК) из клеток на стадии G0 ооцитарному ремоделирующему фактору/факторам; 2) начало транскрипции эмбрионального генома овцы на 8—16-клеточной стадии (у тех же мышей начало транскрипции происходит уже на поздней двуклеточной стадии). Теоретически такая поздняя активация генома позволяет эмбриону овцы в течение, по крайней мере, двух клеточных циклов репрограммировать и ремоделировать ДНК трансплантированного ядра взрослой клетки. Если последний аспект действительно играет значительную роль в данном эксперименте, будет очень трудно воспроизвести результаты клонирования на других видах млекопитающих, у которых активация эмбрионального генома происходит на более ранних стадиях, чем у овцы [15]. Своей работой Уилмут с коллегами продемонстрировали, что ядра клеток молочной железы взрослой овцы могут быть при определенных условиях репрограммированы цитоплазмой ооцита и дать развитие новому организму. Полученные данные заставили по-новому посмотреть на процесс клеточной дифференциации. Этот процесс, как оказалось, не носит необратимый характер. Совершенно ясно, что цитоплазматические факторы способны инициировать развитие нового организма на основе генетического материала ядра взрослой полностью дифференцированной клетки. Таким образом, биологические часы могут быть повернуты вспять, и развитие организма может начаться из генетического материала взрослой дифференцированной клетки, что полностью противоречит ранее общепринятой биологической догме. Возможные области применения технологии клонирования Техника клонирования в первую очередь сулит большие перспективы для животноводства. В принципе от любого животного, обладающего ценными продуктивными качествами, можно получить многочисленные генетически идентичные копии, обладающие теми же признаками. Важной областью применения клонирования будет создание и размножение клонов трансгенных сельскохозяйственных животных (овец, коров, свиней). Получение трансгенных животных с помощью клонирования имеет ряд преимуществ перед пронуклеарной микроинъекцией — рутинного метода, применяемого в настоящее время. Во-первых, это возможность получать несколько генетически идентичных животных из одной и той же клеточной линии и определенного пола. Во-вторых, в 1,5—2,5 раза сокращается время, необходимое для создания стада трансгенных животных с определенными заданными качествами [11]. Если животные могут быть получены путем переноса ядер из клеточных линий, культивируемых in vitro, возможно проводить специфические генетические модификации, включая интродукцию генных конструкций, удаление или замену определенных генов. У мышей такой подход достигается с помощью микроманипуляций с эмбриональными стволовыми (ES) клетками [17]. Однако установление ES линий у коров, овец, свиней пока не привело к успеху. Рождение в 1995 г. первых двух ягнят после переноса ядер фетальных клеток фибробластов, которые трансфецировали и культивировали в течение нескольких месяцев in vitro, открыло новые возможности в создании трансгенных животных и у этих видов. Возможности модифицировать и проводить селекцию клеток в культуре, а затем получать трансгенных животных путем переноса ядер этих клеток значительно выше и эффективнее, чем при традиционных методах. Данный подход позволяет сделать точную генетическую модификацию у получаемых животных. Однако, по мнению ряда ученых, клонирование, по всей видимости, никогда не будет широко применяться в животноводстве по экономическим соображениям. Кроме того, селекция всегда основывалась на генетическом разнообразии видов, клонирование же фиксирует и сужает это разнообразие. Еще одна из возможных областей применения данной технологии — клонирование редких и исчезающих видов диких животных. Так, Бениршке (Benirschke), вице-президент Зоологического центра воспроизводства исчезающих видов в Сан-Диего, высказал предположение, что возможности клонирования в зоологии огромны. Например, такие виды животных, как лошадь Пржевальского, суматринский носорог или другие редкие виды животных, ткани которых хранятся в криобанке центра, могут быть копированы с помощью данной технологии. Ученые этого центра уже начали работать совместно с китайскими коллегами по созданию криобанка клеток речного дельфина (Yangtze) с последующим клонированием их в будущем. Клонирование также может служить полезным инструментом для воспроизводства тех видов животных, которые никогда не размножаются в неволе, например, гигантского броненосца. Однако в настоящее время при клонировании животных существует ряд нерешенных проблем. Так, для большинства диких видов животных, потенциальных кандидатов для клонирования, не определены оптимальные условия культивирования in vitro, а это — необходимое звено при выполненнии данной процедуры. Возможно ли будет использовать ооциты в качестве реципиентов для ядер от близкородственных неисчезающих видов и смогут ли вынашивать реконструированные ооциты суррогатные матери близкородственных видов? Не ясно, например, как клетки плаценты, несущие геном руандийской горной гориллы, будет взаимодействовать с клетками эндометрия обыкновенной гориллы, содержащейся в неволе. Не следует также забывать что клон взрослого животного получен только у овцы, и неизвестно, насколько эффективно и будет ли вообще работать данный метод на других видах животных. Еще одна область возможного применения технологии клонирования — создание трансгенных животных — доноров органов для ксенотрансплантации, у которых инактивированы антигены, ответственные за иммуноотторжение. Уже проводятся исследования в этой области на свиньях, которые рассматриваются в качестве возможных кандидатов для трансплантации их органов у человека. С помощью технологии клонирования могут быть разработаны новые подходы к диагностике и лечению серьезных наследственных заболеваний человека. Применение технологии клонирования в научно-исследовательских работах может ускорить понимание таких проблем, как рак, формирование организма и др. Появление Долли заставило по-новому взглянуть и на проблему старения, ведь ей самой только 20 мес, а ее ДНК, взятой из донорской клетки, более 8 лет. Стив Паркинсон (Steve Parkinson), президент американской компании Advanced Cell Technology, сообщил, что его компания, используя генетически модифицированные фетальные клетки и технологию переноса ядер, пытается получить плоды свиней и коров, чьи нервные клетки будут исследованы с целью их возможного дальнейшего применения в лечении болезни Паркинсона. Если планы по исследованию клонирования человека получат значительную поддержку в совещательной комиссии по генетике человека (Human Genetics Advisory Commission), эксперименты могут начаться в Великобритании уже в следующем году, пишет The Independent (11. 01.98). Ричард Сид (Richard Seed) сообщил, что он набирает команду специалистов с целью попытаться воспроизвести уникальный эксперимент по клонированию и готов открыть клинику по клонированию человека. Он сказал, что после того, как данная технология будет отработана, 200 000 клонов-детей будут ежегодно рождаться в его клинике. Хотя большинство ученых скептически отнеслись к заявлению Сида, однако, например, по мнению Уилмута, клонирование человека может произойти в течение ближайших 2—3 лет или значительно позже, но в конце концов это случится. Клонирование человека Существуют ли технические возможности клонировать человека в настоящее время? При создании Долли было получено 277 реконструированных ооцитов после проведения 433 попыток слияния кариопласта с цитоплазмой. После культивирования и переноса эмбрионов родился только один живой ягненок. Если также предположить, что эффективность удаления ядерного материала ооцита-реципиента составила около 50%, то для клонирования одной овцы понадобилось 1000 зрелых ооцитов. Таким образом, эффективность получения Долли составила всего 0,1%. При гормональной стимуляции женщин в среднем получают 10 зрелых ооцитов. Если эффективность клонирования человека будет схожей с экспериментом Уилмута, то для получения одного клонированного ребенка необходимо будет провести почти 100 циклов гормональной стимуляции и 30 переносов эмбрионов. Такое огромное количество ооцитов, необходимое для получения одного клона, делает клонирование на данном этапе трудно выполнимым. Однако можно предположить, что улучшение со временем этой технологии значительно повысит эффективность клонирования. К тому же в мире существует большое число клиник, занимающихся лечением бесплодия и практикующих различные виды микроманипуляций — ИКСИ, биопсию полярного тельца и бластомера, удаление цитоплазматических фрагментов и др. Обладая этими навыками, эмбриолог может довольно быстро освоить технологию переноса ядер. Таким образом, с технической точки зрения клонирование человека выглядит вполне выполнимым проектом. Насколько клоны похожи на родителя? Один из самых дискутируемых вопросов, связанных с перспективой клонирования человека: Насколько клоны будут похожи на своего родителя? Клоны никогда не будут полностью идентичны своим прародителям. Даже Долли является не точной копией овцы, клетки которой использовали для клонирования, так как она росла и развивалась совсем в другом окружении, в матке другой суррогатной овцы. Долли не унаследовала «свои» гены митохондриального ДНК, она несет митохондриальный геном ооцита реципиента. Клонированного ребенка, вероятно, можно будет назвать «запоздалым» генетическим близнецом своего родителя. Реакция официальных кругов на клонирование людей В США, где в настоящее время нет закона, запрещающего клонирование, президент Клинтон запретил любое федеральное финансирование исследовательских программ по клонированию человека и обратился к Национальной совещательной комиссии по биоэтике с просьбой дать рекомендации по данному вопросу. Комиссия заключила, что должен пройти определенный период (3—5 лет), в течение которого не должны предприниматься попытки создания детей с использованием метода клонирования — переноса ядер соматических клеток. Комиссия также рекомендовала 1) продолжить существующий мораторий на использование федерального финансирования любых попыток создания детей с помощью клонирования; 2) обратиться ко всем фирмам, клиницистам, исследователям и профессиональным обществам, работающим в частных и нефедерально финансируемых секторах, с призывом присоединиться к федеральному мораторию. Она заявила, что профессиональным и научным обществам следует понять, что любые попытки создания ребенка с помощью переноса ядер соматических клеток и имплантации в материнский организм возникающего после этого эмбриона в настоящее время будет безответственным, неэтичным и непрофессиональным актом. Конгресс пересмотрит этот вопрос через 3—5 лет и решит, действительно ли следует запрещать клонирование в дальнейшем. В настоящее время морально неприемлемы как в федеральных, так и в частных клиниках и исследовательских центрах любые попытки создания детей методом клонирования. Имеющаяся научная информация указывает на то, что данный метод нельзя считать абсолютно безопасным для человека. Американское общество репродуктивной медицины (ASRM) также заявило, что находит практику клонирования людей неприемлемой. Однако оно считает, что исследования в области эмбриологии человека вполне приемлемы, очень важны и должны проводиться. Все 13 членов совета Европы и еще 6 европейских стран подписали первый международный закон, запрещающий клонирование человека. Это соглашение запрещает «любое вмешательство, ведущее к созданию человека, генетически идентичного другому человеку, как существующему в настоящий момент, так и умершему, без исключения, даже в случае абсолютного бесплодия у супружеской пары». Заключение Долли остается пока единственным животным, клонированным из взрослой клетки. Ни одна исследовательская группа, в том числе и рослинская, не смогла пока получить второе такое животное. По ряду причин этических, нравственных, религиозных клонирование человека недопустимо в настоящее время. Но самая главная причина заключается в том, что данный метод нельзя считать абсолютно безопасным в настоящий момент. Так, не совсем ясно, как скажутся на клонах влияние генетического импринтинга, старение организма и клетки, а также возможные мутации в ядрах клеток-доноров. Хотя клонирование человека пока что неприемлемо, сопутствующие научные знания и подходы могут быть уже сейчас полезными в разработке новых методов лечения бесплодия. Так, ооциты, полученные от молодых здоровых женщин, могут быть использованы в качестве доноров цитоплазмы в случае ооцитарного фактора отсутствия оплодотворения. J. Zhang [22 ] уже провел работу, в которой использовал незрелые ооциты, находящиеся на стадии GV, полученные от молодых (1-я группа) и «старых» пациенток (2-я группа). Клеточные ядра были успешно перенесены из 7 ооцитов 2-й группы в предварительно энуклиированные ооциты 1-й группы. Через 2 сут 4 из 7 реконструированных ооцитов дозрели до стадии MII и показали нормальный кариотип. John Rock, президент ASRM, заявил, что предварительные результаты этой работы являются многообещающими для области развития вспомогательных репродуктивных технологий и могут сделать возможным для немолодых пациенток зачатие генетически собственного ребенка при использовании энуклиированных донорских ооцитов и генетического материала от их собственных ооцитов. Данный подход может также быть использован в случаях наследственных митохондриальных заболеваний. Несмотря на то, что первоначальная реакция повсеместно была направлена против клонирования человека, сейчас имеются высказывания, что эта технология может быть использована для лечения некоторых видов бесплодия, например, при отсутствии или абсолютной дисфункции половых желез у мужчин и женщин, а также, возможно, даже и у гомосексуальных пар. Так как же ответить на вопрос: следует ли клонировать человека? Конечно, научный прогресс не остановить. Не так давно многих возмущали «дети из пробирки», а раньше крайне удивляли самолет, кинематограф, телевидение, лазер и др. Наверное, все равно настанет время, когда, по крайней мере, данные, полученные в области клонирования людей или на основе его принципов, войдут в повседневную жизнь. Хотелось бы только, чтобы общественное мнение, способное сдерживать развитие вспомогательных репродуктивных технологий, базировалось не на поверхностных или местечковых представлениях о них, а на глубоком знании предмета, и было направлено на благо как сегодняшнего человека, так и будущих поколений. П.А.Гоголевский, В.М.Здановский Московский центр по лечению бесплодия ЭКО; кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РГМУ, Москва |