Контроль и улучшение системы культивирования
|
Высокое качество среды для культивирования – основной залог успеха выполнения программы ЭКО.
Среда для оплодотворения должна быть простой. Из-за присутствия мертвых сперматозоидов и дегенерирующих клеток кумулюса невозможно оценить все вовлеченные процессы. Простые среды на основе Эрла и TALP наиболее пригодны для этих условий. Затем имеются две возможности. Можно исключить из среды глюкозу или уменьшить ее содержание до начала активации эмбрионального генома и затем добавить ЭДТА (24 ч после оплодотворения). Однако это не соответствует естественному окружению in vivo, когда ранний преимплантационный эмбрион окружен богатой средой, содержащей глюкозу. Молекулы этой среды, такие, как гипотаурин, цитрат, малат и др., могут играть важную роль в клеточной регуляции. Глюкоза и фосфаты присутствуют в естественном окружении эмбриона в маточных трубах. Однако почему данные вещества являются токсичными в условиях in vitro, неизвестно. Полагают, что одновременное присутствие глюкозы и неорганических фосфатов ингибирует митохондриальную активность эмбриона. В процессе метаболизма эмбрион превращает глюкозу в молочную кислоту. Последняя ингибирует гликолиз, который в свою очередь снова ингибирует митохондриальную активность. Эмбрионы человека продуцируют in vitro большое количество молочной кислоты, намного больше, чем in vivo. Все среды для культивирования эмбрионов человека содержат молочную кислоту. Есть ли какие-либо доказательства благоприятного влияния молочной кислоты на развитие преимплантационного эмбриона человека in vitro? Аминокислоты необходимы для нормального развития эмбриона. Однако в процессе метаболизма аминокислот высвобождается аммоний, являющийся очень токсичным веществом. Lane и Gardner (1995) применили метод удаления аммония из среды с помощью ферментативной реакции (глутаматдегидрогеназа, NADH+ кетоглутарат). Однако прежде чем данные ферменты могут быть внедрены в существующую систему культивирования, должна быть продемонстрирована их полная безопасность. Состав ионов культуральной среды исследован недостаточно хорошо, так как это почти невыполнимая задача. Но возможно этой проблемы можно обойти путем добавления в среду осмолитов подобно бетаину и таурину. Организм человека имеет буферную систему, которая способна предотвращать вред, наносимый радикалами кислорода клеткам и тканям. Емкость этой буферной системы (TRAP) у здорового человека более чем 1200 моль/л. Величина TRAP во всех IVF средах менее чем 100 моль/л. Создание сред с TRAP, близким к физиологическому значению, возможно улучшит частоту имплантации за счет исключения или уменьшения повреждающего действия радикалов на эмбрион, клеточные органеллы и мембрану, а также предотвращения затвердевания зоны пеллюцида. В регулярной практике ЭКО для контроля качества и условий культивирования и токсичности в средах можно использовать следующие уравнения: Рn/Оo = ~70% Еm/Рn= ~95% Еm/Оo= ~65% где, Оo – ооциты; Рn – оплодотворенные ооциты на стадии пронуклеусов; Еm – эмбрионы (2–4-клеточные через 48 ч после инсеминациии. Снижение приведенных параметров указывает на существующие проблемы в системе культивирования. Прозрачность и гомогенность цитоплазмы эмбриона могут служить косвенным критерием качества эмбриона. Цитоплазма раннего эмбриона должна быть светлой и гомогенной. Появление гранул и различных цитоплазматических включений является плохим признаком. Степень фрагментации эмбриона также хороший индикатор качества среды. Морфология эмбриона строго не коррелирует с его потенциалом к развитию, за исключением полностью аномальных эмбрионов. Однако наблюдение за темпами роста эмбриона и его морфологией в большинстве лабораторий является действующим контролем качества. Имеются наблюдения, что темпы клеточного деления эмбриона отражают его потенциал к имплантации: чем быстрее эмбрион развивается, тем вероятнее наступление беременности. Двухклеточный эмбрион формируется примерно через 24 ч после имплантации и достигает 4–8-клеточной стадии еще через 24 ч. Стадии морулы эмбрион достигает на 3–4-й день. Замедление формирования данных стадий является плохим признаком и может говорить о нарушении в развитии эмбриона. Но эмбрионы с замедленным развитием не обязательно имеют плохое качество, они также могут результировать наступление беременности и рождение здоровых детей. Трудно определить, является ли нарушение развития эмбриона следствием плохих условий культивирования или других факторов, таких, как плохое качество используемых гамет, аномалии эмбрионального генома. В настоящее время применяется следующая классификация эмбрионов: 1-й класс – равномерные, симметричные бластомеры без фрагментов; 2-й класс – легкая асимметрия бластомеров и/или небольшая цитоплазматическая фрагментация; 3-й класс – увеличение асимметрии между бластомерами и цитоплазматической фрагментации; 4-й класс – по крайней мере, один интактный бластомер и интенсивная цитоплазматическая фрагментация. Эмбрионы способны к репарации небольших дефектов, так что даже эмбрионы 2-го и 3-го классов способны имплантироваться после переноса эмбриона. Инвазивные методы оценки качества эмбриона, предусматривающие биопсию одного или двух бластомеров с последующим генетическим или биохимическим анализом, не нашли еще широкого применения из-за дороговизны, а также существующих запретов в ряде стран. После пункции фолликулов было отмечено, что ооциты, находящиеся на стадии МI, имеют более низкий потенциал в плане наступления беременности, чем ооциты на стадии МII, даже в случае, если эти ооциты дозревают in vitro, оплодотворяются и развиваются в морфологически нормальные эмбрионы. Не следует забывать, что вариабельность генетического материала в сперматозоидах, участвующих в оплодотворении, играет значительную роль в качестве эмбрионов. Все перечисленные выше критерии могут служить косвенным контролем качества культивирования. Однако только приемлемая частота наступления беременности после переноса эмбрионов подтверждает, что условия культивирования в лаборатории являются удовлетворительными. Подготовил П.А. Гоголевский на основе работ Menezo, Michelmann и Vermeiden, опубликованных на страницах Ferti.net Московский центр по лечению бесплодия ЭКО, Москва |