Особенности морфофункциональных характеристик половых клеток у больных варикоцеле
|
Впервые связь варикоцеле с бесплодием была показана Тulloch в 1952 г., и с тех пор это мнение поддерживается большинством исследователей [5, 12, 14]. Данные последних лет, полученные при исследовании искусственного осеменения и теста пенетрации спермы – одного из наиболее объективных критериев фертильности гамет, также свидетельствуют, что фертильность при варикоцеле достоверно ниже [15]. Однако если определенную связь между варикоцеле и мужским бесплодием трудно отрицать, то морфофункциональный субстрат последнего еще не выявлен. Это и определило цели и задачи исследования: клинико-экспериментальное изучение сдвигов морфофункциональных характеристик гамет эякулята при варикозном изменении вен мошонки и выяснение некоторых патогенетических аспектов их формирования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Опыты были поставлены на 719 белых беспородных половозрелых крысах-самцах массой 270–350 г и 60 самках массой 230–290 г возрастом от 4 мес до 1 года. Выбор белых крыс в качестве модели для изучения мужской половой системы объясняется тем, что этот вид животных обладает высокой плодовитостью и круглогодично размножается в условиях вивария [3, 6, 7, 10]. Нарушение венозного оттока от половых желез моделировалось посредством перевязки семенниковых вен у места их впадения в нижнюю полую вену или в общие подвздошные вены, где это можно сделать, не затрагивая артериальные сосуды [2]. Для моделирования одностороннего нарушения венозного оттока от семенников было использовано 575 животных (1-я группа); 85 животным была проведена ложная операция, заключавшаяся в тех же манипуляциях без наложения лигатуры (2-я группа). Для опытной и контрольной групп отбирались самцы крыс с однородными показателями морфофункционального состояния сперматозоидов, соответствующими норме. С этой целью трехкратно получали эякулят (ежедневно в течение 3 дней) разработанным нами методом стимуляции семяизвержения 2% раствором окситоцина. Кроме того, использовался оригинальный способ электростимуляции семенного бугорка [1]. Операции выполнялись на следующий день после получения третьего эякулята у интактных крыс. Самцы опытной (1-й) и контрольной (2-й) групп подвергались стимуляции окситоцином или электростимуляции для получения эякулята на 7, 14, 21, 30, 45, 60, 75, 90 и 120-е сутки после операции. Сперматозоиды исследовались по описанным ниже методикам. С целью изучения оплодотворяющей способности половых клеток после одностороннего нарушения венозного оттока от семенников по 10 самцов 1-й группы подвергались спариванию с интактными самками в период с 30-х по 70-е сутки после наложения лигатуры. В каждый из исследуемых сроков использовалось 20 самок. Также было обследовано 366 мужчин с варикоцеле в возрасте от 21 до 41 года, обратившихся по поводу бесплодия. Продолжительность заболевания составляла от 6 мес до 15 лет. У 340 (92,5%) мужчин варикозное расширение вен выявлено с левой стороны, у 16 (4%) – с обеих сторон и лишь у 10 (3%) – справа. Первая степень заболевания (по классификации Нечипоренко, 1964) диагностирована у 63 (17%) больных, вторая – у 219 (60%), третья – у 84 (23%). Исследование эякулята, полученного путем мастурбации после 3–4 дней полового воздержания, проводилось у больных варикоцеле и в контрольной группе (92 мужчины, имеющие беременных жен). Сперматозоиды животных и человека исследовали по стандартной схеме (ВОЗ, 1986): а) определение количества сперматозоидов. С этой целью 0,1 мл разведенного эякулята животных переносили в пробирку, содержащую 0,9 мл среды 199, и тщательно перемешивали. Разведение эякулята мужчин в 20 раз производили в лейкоцитарном меланжере. Подсчет проводили в камере Горяева; б) оценка подвижности сперматозоидов. Исследовали подвижность сперматозоидов в капле нативного эякулята на стекле. Общее количество анализируемых при этом клеток в каждой пробе равнялось 100. Раздельно учитывались сперматозоиды, совершающие активные поступательные (нормокинезис), колебательные без продвижения вперед (гипокинезис) движения, а также неподвижные сперматозоиды (акинезис). Результаты выражали в процентах. У части больных варикоцеле (43) и всех самцов крыс определяли скорость и траекторию движения половых клеток в эякуляте с помощью устройства на базе телевизионного микроскопа и компьютера. С этой целью каплю эякулята, накрытую покровным стеклом, помещали под объектив телемикроскопа и производили съемку инвертированного изображения с экрана монитора на пленку с выдержками от 1 до 6 с. При этом на фотопленке фиксировались треки движения половых клеток, по которым рассчитывалась линейная скорость движения сперматозоидов (в мкм/с) и оценивалась траектория их движения. Подсчет морфологических форм сперматозоидов животных проводился на мазках, окрашенных эозин-нигрозином, а сперматозоидов мужчин – на мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для выяснения абсолютного количества клеток в половых железах самцов крыс сначала подсчитывали число сперматозоидов в гомогенате семенника на единицу массы органа. В гомогенаты также добавлялась среда 199, подсчет клеток проводился по методике, аналогичной таковой при подсчете клеток в эякуляте. Зная абсолютное количество сперматозоидов в единице массы органа (расчет велся на 1 мг) и долю (процент) содержания их в яичке по данным цитометрии на мазках из ткани тестикул, вычислялось абсолютное их количество в мужской половой железе на единицу массы. Количество половых клеток оценивалось (раздельно) в головке и хвосте придатка яичка. Кроме того, гаметы из яичка и его придатка исследовались по той же схеме, что и клетки эякулята. Статистическая обработка материала проводилась с применением критерия Стьюдента и непараметрического критерия Т. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследования эякулятов мужчин с варикоцеле, состоящих в бесплодных браках, жены которых были признаны при гинекологическом обследовании практически здоровыми, показали, что в этой группе речь чаще (в 66% случаев) шла лишь о достоверном снижении описанных выше показателей спермограмм в сравнении с контрольной группой, но не в сравнении с предложенной ВОЗ (1987) нижней границей показателей, характеризующих фертильную сперму. В наших исследованиях ниже этого уровня показатели спермограмм отмечались лишь у 31% больных варикоцеле, состоящих в бесплодных браках. Аналогичные результаты, полученные другими исследователями, часто трактуются ими как доказательство отсутствия связи между варикоцеле и бесплодием [11]. Однако, на наш взгляд, они являются лишь отражением относительной диагностической ценности самих рутинных методик оценки качества спермы. Сказанное нельзя целиком отнести лишь на счет недостаточной подготовленности персонала лабораторий, поскольку, например, при определении подвижности гамет возникают и объективные сложности, обусловленные, в частности, функциональными особенностями зрительного анализатора, ставящего число перемещающихся объектов в поле зрения в прямую зависимость от их общего числа (Шмидт и соавт.,1985). Использование в этих условиях фототелевизионного устройства позволило показать, что нарушение двигательной активности гамет при бесплодии, ассоциированном с варикоцеле, значительно глубже и наблюдается у 91% обследуемых, средняя скорость прямолинейного движения гамет у которых снижалась до 15,9±0,7 мкм/с (р меньше 0,05). Характер движения гамет был также существенно изменен. Количество клеток с криволинейным характером движения было увеличено до 67,2±4,1% от всех поступательно перемещающихся клеток. Таким образом, для эякулятов больных варикоцеле, несмотря на отсутствие грубых нарушений показателей спермограмм и их гетерогенность, характерен ряд изменений, доминирующее положение среди которых занимало нарушение характера их двигательной активности, проявляющееся уменьшением числа прямолинейно перемещающихся клеток, скорости их движения, а также увеличением в популяции количества криволинейно и беспорядочно и очень быстро перемещающихся сперматозоидов и числа гамет с активными латеральными смещениями головки. Справедливость такого вывода была проверена экспериментально. Для половых клеток интактных самцов белых крыс были характерны высокая подвижность и жизнеспособность при высокой концентрации в ограниченном объеме эякулята. Так, общее количество сперматозоидов в эякуляте равнялось 11,6±1 млн. Подвижных гамет в эякулятах было 10±1 млн. (85±2%), причем поступательно перемещающихся было 65±3,5%. При исследовании на светооптическом уровне структуры половых клеток было выявлено, что 95±1% их имеют морфологически нормальное строение головки, тела и хвоста. Через 2 нед после перевязки левой внутренней семенниковой вены количество сперматозоидов достоверно уменьшалось до 8,4±0,6 млн., при этом процент живых клеток снизился до 71,9±2, а количество подвижных клеток в эякуляте – до 5,6±0,4 млн. (66,7±2,9%). Количество прямолинейно перемещающихся клеток на 14-е сутки опыта составляло 24,1±2,3%. На 30-е сутки эксперимента продолжалось ухудшение показателей спермограмм животных. Так, количество сперматозоидов через месяц после перевязки составило 3,6±0,4 млн., из них 1,6±0,3 млн. сперматозоидов в эякуляте обладали подвижностью (43,9±7,1%), тогда как поступательно перемещающихся было только 16,7±2,6% клеток. В последующие сроки эксперимента показатели спермограммы оставались на этом минимальном уровне вплоть до окончания эксперимента на 120-е сутки после операции. Таким образом, у животных с экспериментальным варикоцеле, также, как и у мужчин с этой патологией, выявлялись достоверно более низкие, чем в контроле, показатели спермограмм. Динамическое их исследование по мере увеличения сроков с момента окклюзии внутренней яичковой вены является убедительным доказательством существования прямой причинно-следственной связи между веногипертензией и патоспермией. Доминирующим и наиболее рано выявляемым феноменом в эксперименте, также, как и в клинике, явилось нарушение подвижности гамет. Изучение характера движения половых клеток крыс с использованием фототелевизионного метода показало, что наряду с полной утратой подвижности и снижением скорости их поступательного перемещения выявляется прогрессирующее и достоверное увеличение, начиная с 7-х суток эксперимента, числа клеток со своеобразным характером движения. Такие клетки перемещались прямолинейно с очень низкой (5–2,5 мкм/с) скоростью. В то же время скорость криволинейного движения была у этих клеток практически в 1,5–2 раза выше нормы (30±3,4 мкм/с), что сочеталось с резкими толчкообразными боковыми смещениями головки. В контрольной группе животных число таких клеток через 30–90 мин после ресуспендирования в среде 199 составляет 3–4% от общего числа подвижных клеток. У животных опытной группы уже через 7 дней после оперативного вмешательства число таких клеток составляло в отдельных случаях более 60% от числа всех подвижных клеток (в среднем 54±4,0%, р меньше 0,05 ). В более поздние сроки эксперимента эти показатели оставались на достигнутом в 1-ю неделю уровне. Выявленные нами в клинике и эксперименте изменения характера движения гамет эякулята рассматриваются в последнее время в качестве признака их активации в процессе капацитации, с чем и связано название этого феномена – гиперактивация [9]. При инкубации половых клеток гиперактивация предшествует акросомальной реакции и коррелирует с ее интенсивностью [8, 16]. Выявленное нами увеличение числа гиперактивированных гамет может, как нам кажется, свидетельствовать о нарушении при варикоцеле процесса хранения гамет в добавочных половых железах и, в частности, придатке яичка, играющего, как известно, ведущую роль в регуляции процесса капацитации за счет выработки декапацитационных факторов преимушественно гликопротеиновой природы [12, 13]. Известно, что эффективность оплодотворения находится в прямой зависимости от адекватной капацитационной активности мужских гамет, тогда как увеличение сроков их инкубации снижает этот показатель [6]. Наши экспериментальные данные показали, что при спаривании самцов крыс опытной группы через 30–70 сут после перевязки внутренней яичковой вены беременность у интактных самок развивалась в 4 раза реже (20% против 85,8% в норме), число эмбрионов уменьшалось на 30% (с 9,65±0,33 до 6,24±0,75), тогда как эмбриональная смертность увеличивалась (с 6,35±1,2 до 40,83±5,34%), причем за счет как преимплантационной (в 5 раз), так и постимплантационной (в 20 раз) смертности. В целях выяснения степени вовлечения придатка яичка в патогенез формирования инфертильности при варикоцеле мы изучали морфофункциональные характеристики сперматозоидов из разных отделов эпидидимиса. Такой подход позволяет не только косвенным образом выявить особенности дисфункции придатка яичка «по конечному результату», но и, что особенно важно, оценивать тонкие механизмы нарушения фертильности гамет, формирующегося на посттестикулярном этапе гаметогенеза. По понятным причинам он не может быть использован в условиях клиники. Исследование на крысах показало, что у животных контрольной группы соотношение общего числа сперматозоидов семенника и придатка составляло 1:4. После перевязки левой семенниковой вены этот показатель существенно не изменялся на протяжении всего периода наблюдений.Однако внутри самого придатка семенника наблюдалась совершенно иная картина. Так, если в контрольной группе животных соотношение числа гамет из семенника, головки и хвоста его придатка составило 1:1,3:4, то при экспериментальном варикоцеле этот показатель составил уже 1:4:4 во все сроки наблюдения, что указывало на их перераспределение внутри органа. Об относительном приросте числа сперматозоидов в проксимальных отделах канальца придатка свидетельствовало и описанное нами ранее увеличение числа половых клеток в его просвете на поперечных срезах головки органа, тогда как в норме они там обычно отсутствуют [1]. Кроме того, с 28,2±2,1 до 55,8±2,8% возрастало количество подвижных сперматозоидов из головки придатка, а процесс гиперактивации гамет в его хвосте (все данные 30-х суток опыта) увеличивался в 3–4 раза. Представленные данные позволяют с достаточной уверенностью утверждать, что нарушение гаметогенеза при экспериментальном варикоцеле не ограничивается угнетением сперматогенеза, но сопряжено и с нарушением пассажа гамет через эпидидимис, сопровождающимся их задержкой в проксимальных отделах канальца этого органа. Известно, что механизм продвижения сперматозоидов в проксимальных и дистальных сегментах придатка семенника несколько различен. Так, лишь в головке он обусловлен преимущественно током жидкости, секретируемой сетью яичка. Однако уже в теле эпидидимиса ведущая роль принадлежит мышечному аппарату самого органа. Чрезвычайно важно и то, что в опытах по искусственному замедлению процесса перемещения гамет через орган, скорость которого в физиологических условиях является, по мнению большинства исследователей, постоянной, приводит к достоверному увеличению эмбриональной смертности, уменьшению многоплодия самок и снижению их оплодотворяемости [4], то есть именно к тем изменениям фертильности гамет, которые были выявлены нами у самцов крыс с экспериментальным варикоцеле. Выводы 1. При изучении морфофункциональных характеристик гамет эякулятов стандартными методами нередко не удается выявить достоверных их отклонений при бесплодии, ассоциированном с варикоцеле, от образцов фертильных мужчин. 2. В то же время детальный анализ двигательной активности гамет с использованием дополнительных методов показывает, что при исследуемой патологии она нарушена у 91% обследованных. 3. Одним из распространенных феноменов изменения движения гамет при варикоцеле является преобладание в эякулятах гиперактивированных сперматозоидов. 4. Этот феномен, являясь одной из существенных причин инфертильности при варикоцеле, может быть обусловлен преждевременно индуцированной капацитационной активностью гамет вследствие дисфункции придатка яичка и, в частности, замедлением транспорта половых клеток через этот орган. С.Б. Артифексов, А.А. Одинцов, А.А. Артифексова Государственная медицинская академия, Областной медицинский центр планирования семьи и репродукции, Москва ЛИТЕРАТУРА 1. Артифексов С.Б. Патогенез сосудистых форм мужской инфертильности. Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. Челябинск 1992; 37. 2. Артифексов С.Б., Рыжаков Ю.Д., Можжухин В.Б. Роль циркуляторной гипоксии в патогенезе варикоцеле. Моделирование, патогенез и терапия гипоксич.сост. Сб. науч. трудов Горький 1989; 32–36. 3. Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Баранов В.С., Самошкина Н.А., Чеботарь Н.А. Лабораторные млекопитающие: мышь, крыса, кролик, хомячок: объекты биологии развития. М 1975;505–567. 4. Левин К.Л. Физиология и патология воспроизводства свиней. М 1990; 255. 5. Люлько А.В., Кондрат П.С. Варикозное расширение вен семенного канатика (варикоцеле). Душанбе 1989; 208. 6. Репин В.С. Критические факторы регуляции развития. М 1980; 235. 7. Физиология человека (под ред. Р. Шмидта). М 1985; 2:37. 8. Blother S., Betrem R., Pitra C. Speciesspectictishe Motilitatsmuster hyperaktivaerter Sa geties spermatozoen und die quentitative Auswertung der hyperactivicrung von Bullenspermatozoen. Andrologia 1989;21:3:204–213. 9. Burkman L.I. Temporal patton of hyperactivation–like motiliti in human spermatozoa. Biol Reprod 1986;34:226–232. 10. Daniel E.G. Methods in mammalian embriology. N Y London 1971;98. 11. Farris B.L., Fenner D.K., Plymate S.P., Branner C.E., Jacov W.H. Seminal characteristics in the presence of a varicocele as compared with thouse of expectant father and prevasectomy man. Fertil Steril 1981;35:3:325–327. 12. Fraser L.R., Harison A.P., Herod I.E. Characterization of a decapacitation factor associated with epididymal mouse spermatozoa. J Reprod Fert 1990; 89: 1: 135–148. 13. Goddard R.D., Cooper T.G. Epididyme et fertilite masculine. Contracept Fertil Sex 1987; 15: 1: 107–109. 14. Ito H.S., Yanagi S., Kawamura K., Kataumi Z., Igarashi T., Semiga H. Varicocele and pathogenesis of male infertility. Is varicocele a cause of male infertility? Nish ihon J Urul 1986; 48:5:1105–1111. 15. Prymat S.R., Negao R.R., Muller Ch.N., Paulsen C.A. The use of sperm penetration assay in evaluation of men with varicoceles. Fertil Steril l987; 47: 3(a): 680–683. 16. Tesarik Y., Mendoza C., Testart Y. Effect of the humen characteristics of human capacitated spermatozoa. Y Reprod Fertil 1990; 88: 2: 665–675. |