Форум РМС

Лечение в Москве - 8 (495) 506 61 01

Лечение за рубежом - 8 (925) 50 254 50

Дисомия хромосом в половых клетках мужчин при нарушении сперматогенеза

Дисомия по половым хромосомам (гоносомам) является одной из распространенных форм хромосомопатии (синдром Клайнфельтера, поли Y и др.) у пациентов с мужским бесплодием [1–5]. Одной из причин развития таких заболеваний является внесение в зиготу мужской или женской половой клеткой лишней гоносомы при оплодотворении. Исследование хромосомного набора в самих половых клетках позволяет составить представление о частоте и причинах возникновения дисомии (нерасхождении) хромосом в гаметах. Это, в свою очередь, будет способствовать разработке профилактических мероприятий с целью снижения уровня хромосомопатий, передаваемых через половые клетки родителей.

Цитогенетическое исследование гамет человека ограничено трудностью получения материала. Практически доступны для анализа лишь мужские половые клетки и то при показаниях к проведению биопсии яичка. Кроме того, анализ хромосом на материале биопсии яичка был возможен лишь на тех стадиях сперматогенеза, на которых хромосомы конденсированы и визуализируются: в сперматоцитах в пахитене, диакинезе-метафазе I и в метафазе II. В зрелых мужских гаметах-сперматозоидах хроматин конденсирован и не пригоден для традиционного цитогенетического исследования. Лишь с конца 70-х годов был разработан метод гетерологичного оплодотворения ооцитов золотистого хомячка сперматозоидами человека, позволивший визуализировать хромосомы сперматозоидов и анализировать их [6, 7].

C развитием молекулярно-цитогенетических методов стало возможным с помощью хромосомоспецифичных ДНК-зондов проводить анализ хромосом не только в метафазных, но и интерфазных клетках, в том числе и в половых на разных стадиях их развития [8–13, 24].

Материал и методы

Определяли частоту нерасхождения хромосом (гоносом и некоторых аутосом) у 17 пациентов с нарушением сперматогенеза при нормальном кариотипе (2-я группа) и у 7 пациентов при аномальном кариотипе (3-я группа). В качестве контрольной (1-й) группы обследовали 37 мужчин с нормальной спермограммой и нормальным кариотипом. Молекулярно-цитогенетический анализ гамет проведен у 3 пациентов из этой группы.

В схему клинико-генетического обследования [5] входило традиционное спермиологическое исследование эякулята [15], количественный кариологический анализ незрелых половых клеток (НПК) из эякулята, цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови, молекулярно-цитогенетическое исследование препаратов клеток эякулята [14].

Спермиологический анализ эякулята выполнялся дважды у большинства пациентов по методу, рекомендованному ВОЗ [15]. По результатам спермиологического анализа пациентов относили к одной из шести групп [15]. Суховоздушные препараты половых клеток из эякулята получали общепринятыми методами [16, 17] и окрашивали по методу Гимзы для проведения количественного анализа состава НПК по разработанному нами способу [18]. FISH-анализ на препаратах половых клеток из эякулята проводили по M.Guttenbach и соавт.[14].

В целях определения анеуплоидии в половых клетках как показателя нерасхождения хромосом в мейозе в 27 случаях были проведены молекулярно-цитогенетические исследования клеток эякулята. FISH проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для гоносом (Х и Y) и аутосом (хромосомы 1, 4, 10, 13+21, 18). В исследовании применяли хромосомо-специфичные ДНК-пробы из оригинальной библиотеки, предоставленные Ю.Б. Юровым [19, 20]. Аутосомные ДНК-пробы применяли для оценки нерасхождения соответствующих хромосом в мейозе.

Результаты и обсуждение

У 3 пациентов с нормальным кариотипом и нормоспермией (1-я группа) не выявлено дисомии хромосом X, Y, по данным молекулярно-цитогенетического исследования гамет.

У некоторых из обследованных нами 17 пациентов с нормальным кариотипом и нарушением сперматогенеза (2-я группа) выявлено увеличение числа дисомных гамет по сравнению с частотой дисомии в сперматозоидах у здоровых мужчин [10, 21]. Согласно данным [10, 21], уровень нерасхождения половых хромосом в сперматозоидах здоровых мужчин с нормальным кариотипом и спермограммой составляет 0,05–0,1%, а уровень нерасхождения аутосом – 0,04–0,4% (в зависимости от хромосомы) от общего числа подсчитанных клеток.

У одного из пациентов с астенозооспермией, у которого молекулярно-цитогенетический анализ сперматозоидов и сперматид проводили дважды, на двух образцах эякулята, полученных с интервалом в 7 мес, в 1-м образце выявлена дисомия по хромосоме 1 в 36% сперматозоидов, во 2-м – в 57% сперматозоидов.

У пациента с кариотипом 46,XY,t(1;13) и азооспермией на суховоздушных препаратах клеток эякулята выявлено лишь 10 сперматозоидов, в 3 из них определена дисомия хромосомы 1. Из 93 сперматид в 22 (около 24%) также определена дисомия хромосомы 1, в 1 сперматиде, а также в 1 из 148 проанализированных сперматоцитов выявлена трисомия по хромосоме 1. Возможно, что транслокация хромосом 13 и 1 у данного индивидуума является причиной нарушения расхождения хромосом в делениях созревания гамет и как следствие – дисомии по хромосоме 1 в сперматидах и сперматозоидах. Не исключено, что высока вероятность передачи лишней хромосомы при дисомии гамет потомству при использовании ИКСИ. Поэтому в схеме клинического обследования следует проводить медико-генетическое консультирование пациента, молекулярно-цитогенетическое исследование гамет, преимплантационную и/или пренатальную диагностику плода на носительство хромосомной патологии [5].

Нами исследованы половые клетки 6 пациентов с синдромом Клайнфельтера (в одном случае – мозаичная форма). При молекулярно-цитогенетическом анализе частоты нерасхождения хромосомы Х в случае мозаицизма 47,XXY[94]/46,XY[6] дисомия выявлена в 43% сперматозоидов и сперматид, определены 3 гибридизационных сигнала и более в 22% клеток. У пациентов с кариотипом 47,XXY частота дисомии Х в сперматозоидах (если таковые выявлялись) и сперматидах колебалась от 6 до 40%. Столь высокую долю дисомии по хромосоме Х в гаметах пациентов с синдромом Клайнфельтера по сравнению с уровнем дисомии, в том числе по хромосоме Х, у мужчин с нормальным кариотипом и нормоспермией [10, 21] можно объяснить нарушением процесса конъюгации и затем – нерасхождения хромосом в мейозе у лиц с нарушением числа (как и у обследованных нами пациентов) или структуры хромосом в кариотипе. В принципе, и у индивидуумов с нормальным кариотипом в 20–25% сперматоцитов на стадии зиготены–пахитены происходит нарушение конъюгации хромосом, и такие клетки дегенерируют, что является физиологической селекцией на уровне гамет [22]. По-видимому, у пациентов с кариотипом 47,XXY высока частота нарушения мейоза на стадии зиготены–пахитены и лишь малая доля сперматоцитов завершает мейоз и переходит в сперматиды и сперматозоиды. Это подтверждается семиологическим исследованием состава НПК эякулята. Такая остановка процесса сперматогенеза приводит к интенсивной гибели половых клеток и может явиться причиной азоо- или олигозооспермии тяжелой степени. В литературе практически отсутствует информация относительно уровня хромосомных аномалий как в зрелых (сперматозоиды), так и в незрелых половых клетках (сперматоциты и сперматиды) у пациентов с полной формой синдрома Клайнфельтера [24].

При использовании гетерологичного оплодотворения ооцитов хомячка сперматозоидами пациента с кариотипом 47,XXY/46,XY (т.е. носителя мозаичного кариотипа) было выявлено увеличение частоты гипергаплоидии – 24,XY сперматозоидов до 0,9% [23]; данные о наличии 2% сперматозоидов с дисомией Х в эякуляте пациента с таким же мозаичным кариотипом были также получены ранее с помощью техники FISH [24]. Полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что у пациентов с кариотипом 47,XXY может, по-видимому, происходить предпочтительная конъюгация гомологичных гоносом (в этих случаях хромосомы ХХ) и некоторые из таких гамет способны проходить через мейоз, формируя сперматозоиды [10, 23]. Однако у таких пациентов и в сперматидах и в сперматозоидах высока доля клеток с нерасхождением хромосом, что необходимо учитывать при проведении ИКСИ.

Наши данные прежде всего подтверждают необходимость проведения медико-генетического консультирования, в том числе цитогенетического исследования по лимфоцитам периферической крови пациентов с бесплодием неясного генеза. Установление нормального кариотипа свидетельствует лишь о том, что отсутствуют нарушения числа и структуры хромосом, выявляемые традиционным цитогенетическим методом. Однако это не исключает вероятности наличия микроструктурных перестроек хромосом или генных мутаций, выявление которых требует использования иных, чем традиционные цитогенетические исследования, а именно: молекулярно-цитогенетических методов исследования. Кроме того, как свидетельствуют наши данные, при отсутствии генных и хромосомных нарушений вероятны аномалии развития самих гамет, происходящие и в результате нарушения в них хромосом (вследствие существования определенной автономии гаметогенеза в организме). Это говорит о необходимости проведения в ряде случаев бесплодия анализа поведения хромосом на разных стадиях гаметогенеза. Разработка и использование в последние годы в этих целях молекулярно-цитогенетических методов исследования значительно повысили разрешающую ценность диагностических подходов.

Результаты молекулярно-цитогенетического анализа половых клеток у пациентов с нормальным и аномальным кариотипом и нарушением сперматогенеза подтверждают точку зрения на возможность выявления в гаметах, в первую очередь – в сперматозоидах и сперматидах, определенной доли хромосомных анеуплоидий. Последние могут явиться причиной нарушения сперматогенеза. Некоторые из таких сперматозоидов участвуют в оплодотворении и могут являться причиной формирования эмбриона с численным нарушением кариотипа.

Практические успехи использования ИКСИ значительно опережают темпы разработки методов преимплантационной диагностики и углубления наших представлений о последствиях этих методов для здоровья рожденных таким образом детей и популяции в целом.

Таким образом, нами установлена доля аномалии гоносом у лиц с нарушением сперматогенеза при нормальном и аномальном кариотипе, определены показания для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики, подтверждена возможность применения молекулярно-цитогенетических методов для выявления анеуплоидии в интерфазно-подобных ядрах половых клеток.

Решение проблемы определения риска передачи потомству хромосомных и генных мутаций при ИКСИ должно основываться на современных знаниях о хромосомных аномалиях в половых клетках на разных стадиях их развития.

В.О. Шаронин, Л.Ф. Курило, Л.В. Шилейко, Е.В. Мхитарова
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, НИИ клинической генетики Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Авторы выражают глубокую благодарность проф. Ю.Б. Юрову за предоставление хромосомоспецифичных ДНК-проб и проф. С.Г. Ворсановой за возможность выполнения данной работы и участие в обсуждении полученных результатов.

Литература

1. Kleczkowska A., Fryns J., van den Berghe H. X-chromosome polysomy in male: the Leuven experience 1966–1987. Hum Genet 1988; 80: 1: 16–22.
2. Ворсанова С.Г., Шаронин В.О., Курило Л.Ф. Аномалии половых хромосом при нарушении репродуктивной функции у мужчин. Пробл репрод 1998; 4: 2: 12–21.
3. Курило Л.Ф., Шаповал Н.В., Дубинская В.П. и др. Структура хромосомной патологии среди пациентов с нарушением репродуктивной системы. Тез. докл. 1 (3) Рос. съезда мед. генетиков. М 1994; 1: 85–86.
4. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Мхитарова Е.В. и др. Структура наследственной патологии половой системы при обследовании пациентов с нарушением репродукции. Тез. докл. Рос. конф. «Медико-генетическое консультирование в профилактике наследственных болезней». М 1997; 155–156.
5. Курило Л.Ф. Доля генетической патологии у пациентов с нарушением развития половой системы. Сб-к: Лекции для врачей. Сексопатология и андрология, вып. 4. Киев 1998; 18–27.
6. Rudak E., Jacobs P.A., Yanagimachi R. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa. Nature 1978; 274: 911–913.
7. Martin R.H., Balkan W., Burns K. et al. The chromosome constitution of 1000 human spermatozoa. Hum Genet 1983; 63: 305–309.
9. Ворсанова С.Г., Казанцева Л.З., Юров Ю.Б. и др. Использование молекулярно-цитогенетических методов диагностики в генетической практике. Вопр охр мат и дет 1991; 11: 71–76.
9. Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г., Бытенская Г.А. и др. Молекулярно-интерфазная пост- и пренатальная диагностика синдромов, связанных с аномалиями половых хромосом. Сб-к научных трудов. М. МОНИКИ, 1995; 1: 141–150.
10. Blanco J., Egozcue J., Vidal F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in situ hybridization. Hum Reprod 1996; 11: 722–726.
11. Miharu N., Best R.G., Young S.R. Numerical chromosome abnormalities in spermatozoa of fertile and infertile men detected by fluorescence in situ hybridization. Hum Genet 1994; 93: 502–506.
12. Wyrobek A.J., Robbins W.A., Mehraein Y. et al. Detection of sex chromosomal aneuploidies X-X, Y-Y, and X-Y in human sperm using two chromosome fluorescence in situ hybridization. Am J Med Genet 1994; 53: 1–7.
13. Yurov Y.B., Saias M.J., Vorsanova S.G. et. al. Rapid chromosomal analysis of germ-line cells by FISH: an investigation of infertile male with large-head spermatozoa. Molec Hum Reprod 1996; 2: 9: 665–668.
14. Guttenbach M., Schakowski R., Schmid M. Incidence of chromosome 3,7,10,11,17 and X disomy in mature human sperm nuclei as determinad by nonradioactive in situ hybridization. Hum Genet 1994; 93: 1: 7–12.
15. WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge University press 1992.
16. Evans E.P., Breckon G., Ford C.E. An air-drying method for meiotic preparations from mammalian testes. Cytogenetics 1964; 3: 2: 289–294.
17. Templado C., Marina S., Coll M.D. et al. Meiotic Studies in Human Semen. Report of 180 Cases. Hum Genet 1980; 53: 335–339.
18. Курило Л.Ф., Любашевская И.А., Дубинская В.П. и др. Количественный кариологический анализ состава незрелых половых клеток из эякулята. Урология и нефрология 1993; 5: 45–47.
19. Soloviev I.V., Yurov Y.B., Ioannou I. еt al. Identification and molecular-cytogenetic characterization og large subset of human plasmids, cosmids, PAC and YAC clones: the search of DNA probes for pre- and postnatal diagnosis. Cesko-Slovenska pediatrie 1997; 7: 529–538.
20. Yurov Y.B., Soloviev I.V., Vorsanova S.G. et al. DNA probes for pre- and postnatal diagnosis of chromosomal anomalies: a collection for FISH analysis. Cesko-Slovenska pediatrie 1997; 7: 550–554.
21. Guttenbach M., Engel V., Schmid M. Analysis of structural and numerical chromosome abnormalities in sperm of normal men and carriers of constitutional chromosome aberrations. A review. Hum Genet 1997; 100: 1: 1–21.
22. Speed R.M., Chandley A.C. Prophase of meiosis in human spermatocytes analysed by EM microspreading in infertile men and their controles and comparisons with human oocytes. Hum Genet 1990; 84: 547–554.
23. Cozzi J., Chevret E., Rousseaux S. et al. Achievment of meiosis in XXY germ cells: study of 543 sperm karyotypes from an XY/XXY mosaic patient. Hum Genet 1992; 93: 32–34.
24. Курило Л.Ф., Шаронин В.О., Ворсанова С.Г. Уровень нерасхождения хромосом на разных стадиях развития мужских половых клеток человека. Пробл репрод 1998; 4: 6.