Факторы, влияющие на процесс ранней компактизации эмбрионов человека в культуре
|
Первые деления эмбрионов человека – деления дробления – проходят, как и у большинства видов животных, без увеличения размеров образующихся клеток. Это приводит к тому, что размеры эмбриональных клеток – бластомеров – уменьшаются до уровня соматических. Однако процесс дробления у млекопитающих имеет ряд специфических особенностей, в частности, относительно медленный темп делений, своеобразное расположение бластомеров по отношению друг к другу, асинхронность раннего дробления, а также наличие процесса компактизации эмбрионов, в ходе которого ранее рыхло расположенные бластомеры сближаются, площадь контакта между ними увеличивается и они образуют компактный клеточный шар с трудноразличимыми при прижизненном наблюдении границами между отдельными бластомерами. В ходе компактизации между клетками эмбриона устанавливается более совершенная система межклеточных связей, заключающаяся в появлении щелевых, а затем плотных межклеточных контактов [1]. Для осуществления процесса компактизации необходимы ионы кальция, также в нем участвуют цитоскелет и специфические молекулы межклеточной адгезии увоморулины [2, 3].
Вопрос о продолжительности первого клеточного цикла в ходе дробления у человека был изучен в ряде работ. По данным A.Trounson и соавт. [4], первые эмбрионы на стадии двух бластомеров в культуре можно наблюдать через 27 ч после инсеминации ооцитов. Однако, по данным H.Balakier и соавт. [5], длительность этого периода составляет 20–22 ч, а по результатам работы G.Capmany и соавт. [6] – примерно 25 ч. Показано также, что некоторые эмбрионы человека обладают способностью к более быстрому дроблению в культуре [5, 7]. Продолжительность последующих клеточных циклов составляет около 18 ч [2]. Первые компактизованные эмбрионы в культуре можно наблюдать уже на стадии 8 бластомеров (ранняя компактизация эмбрионов). Однако начало этого процесса более характерно для эмбрионов, находящихся на стадии 16 клеток. Вопрос о факторах, оказывающих влияние на появление в культуре эмбрионов c ранней компактизацией, фактически не изучен. Выявление этих факторов явилось целью настоящей работы. Материал и методы Анализ факторов, влияющих на появление в культуре эмбрионов с ранней компактизацией, проведен на основе результатов лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у 470 пациенток Международного центра репродуктивной медицины НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН. Показаниями к ЭКО явились трубно-перитонеальное бесплодие вследствие непроходимости или отсутствия маточных труб, а также отклонение показателей спермограммы от нормы. Для стимуляции суперовуляции использованы кломифенцитрат (клостилбегит) и человеческий менопаузальный гонадотропин (хумегон, пергонал). Для индукции овуляции вводили хорионический гонадотропин при достижении лидирующими фолликулами диаметра 17–18 мм. Для инсеминации ооцитов в среду культивирования вводили 100 000 сперматозоидов. Контроль оплодотворения проводили через 18 ч после инсеминации. Зиготы с двумя пронуклеусами переносили в свежую питательную среду. Через 24 ч с момента контроля оплодотворения (первая оценка) эмбрионы анализировали под микроскопом и определяли число бластомеров и степень фрагментации. Выделяли три основные типа эмбрионов: без фрагментации бластомеров, а также с легкой и тяжелой степенью фрагментации цитоплазмы. Эмбрионы первой группы характеризовались индексом фрагментации 3, второй – 2 и третьей – 1. Вторая оценка развития эмбрионов происходила перед переносом их в полость матки через 48 ч с момента контроля оплодотворения ооцитов (66 ч после инсеминации ооцитов). При этом наряду с оценкой числа и морфологии бластомеров определяли наличие ранней компактизации эмбрионов. Исследование влияния морфологии сперматозоидов на появление в культуре эмбрионов с ранней компактизацией проведено по результатам лечения бесплодия методом ЭКО у 85 женщин. Для анализа морфологии сперматозоидов на препарате клетки отделяли от семенной жидкости. Для этого 0,2 мл нативной спермы помещали в центрифужную пробирку и добавляли 1,5 мл буфера, состоящего из 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 5 мМ MgCl2 и 10 мМ KCl, после чего проводили центрифугирование при 100 000 об/мин в течение 5 мин. Cупернатант сливали и отмывку повторяли дважды, затем осадок ресуспендировали до концентрации 106 клеток в 1 мл, наносили тонким слоем на стекло и высушивали. Препараты фиксировали в 70% этаноле в течение 10 мин, после чего высушивали и окрашивали гематоксилином Харриса и бенгальским розовым (фирма «Fisher Scientific»). Для оценки морфологии сперматозоидов использовали модифицированную классификацию Крюгера [8, 9]. Определение доли клеток с различными морфологическими характеристиками проводили при увеличении 1000 (об. 100, ок. 10), просчитывая по 200 клеток на каждом препарате. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина ее составляет 5–6 мкм, ширина 2,5–3,5 мкм, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии в области шейки, хвоста, срединное тело не выражено. К пограничным формам относили клетки с хорошо выраженным акросомальным участком, имеющие слегка удлиненную головку диаметром 2–2,5 мкм или небольшие утолщения в области шейки. Для обработки полученных данных использовали t-критерий Стьюдента, а также критерий c2. Результаты Ранняя (через 66 ч с момента инсеминации ооцитов) компактизация отмечена у 2,9% (у 57 из 1922) эмбрионов. Эмбрионы на стадии компактизации в среднем имели 7,6±0,3 бластомера, что было достоверно выше (р меньше 0,0001), чем число клеток у некомпактизованных (5,2±0,1). Несмотря на низкую частоту встречаемости данного явления, у некоторых женщин было отмечено одновременное появление нескольких (максимум 4, в среднем 1,74±0,21) компактизованных эмбрионов, что может свидетельствовать о существовании индивидуальной предрасположенности к их формированию. В зависимости от наличия ранней компактизации эмбрионов были выделены две группы женщин. В 1-ю группу были включены 437 пациенток, эмбрионы которых не имели признаков ранней компактизации, во 2-ю – 33 женщины, у которых этот процесс был отмечен. Возраст больных в группах не различался и составлял 31,6±0,2 и 30,8±0,8 года соответственно. Отличий по числу пунктированных фолликулов и полученных ооцитов также не было выявлено, в то же время число зигот и, как следствие этого, полученных и перенесенных в полость матки эмбрионов были достоверно выше во 2-й группе женщин (табл. 1). Выявленные различия могут быть обусловлены влиянием со стороны показателей сперматогенеза мужа. По данным спермограммы мужа, доля прогрессивно-подвижных форм, а также морфологически нормальных сперматозоидов и сперматозоидов с легкой патологией была выше во 2-й группе женщин (табл. 2). Таблица 1. Результаты стимуляции суперовуляции и оплодотворения в культуре
Примечание. *– p меньше 0,05; **– p меньше 0,01. Таблица 2. Показатели сперматогенеза
Примечание. *– p меньше 0,05. При оценке характера развития эмбрионов было показано, что эмбрионы пациенток 2-й группы как через 24 ч, так и через 48 ч после контроля оплодотворения ооцитов имеют большее число бластомеров с менее выраженной фрагментацией цитоплазмы. Аналогичные различия обнаруживаются и при анализе эмбрионов, перенесенных в полость матки (табл. 3). При сравнении частоты наступления беременности у женщин исследуемых групп различий не выявлено. В то же время доля многоплодных беременностей в подгруппе беременных была достоверно выше в тех случаях, когда среди перенесенных в полость матки эмбрионов были эмбрионы с признаками ранней компактизации (табл. 4). Таблица 3. Индекс фрагментации и число бластомеров у эмбрионов
Примечание. Первое наблюдение – 24 ч, второе – 48 ч после контроля оплодотворения. *– p меньше 0,0001. Таблица 4. Частота наступления беременности в исследуемых группах
Примечание. *– p меньше 0,01. Обсуждение Число бластомеров и степень выраженности процесса фрагментации цитоплазмы в настоящее время являются основными критериями для прижизненной оценки развития эмбрионов человека в программе ЭКО [2]. В последнее время в литературе появились данные о том, что традиционная схема контроля оплодотворения по наличию пронуклеусов через 18 ч после инсеминации ооцитов и последующего прижизненного наблюдения за развитием эмбриона через 24 и 48 ч после контроля оплодотворения не позволяет достаточно надежно выявить различия в темпах дробления эмбрионов в культуре. Например, в работе [7] показано, что уже через 25 ч после инсеминации в культуре можно наблюдать появление первых эмбрионов на стадии двух бластомеров. Эти эмбрионы, названные авторами «эмбрионами с ранним дроблением», при последующем переносе в полость матки имплантируются чаще, чем те, у которых процесс дробления начинается позднее. Отбор таких эмбрионов для переноса позволяет существенно повысить частоту наступления беременности. Однако при традиционной схеме контроля оплодотворения выявить такие эмбрионы практически не представляется возможным. Асинхронность развития эмбрионов в культуре обычно связывают с различиями во времени проникновения сперматозоидов в ооциты. Основная причина этого – гетерогенность по степени зрелости женских половых клеток, полученных в результате стимуляции фолликулогенеза. Оплодотворение дозревающих в культуре ооцитов приводит к задержке дробления эмбрионов [4]. Появление эмбрионов с ранним дроблением не зависит от характеристик сперматогенеза, особенностей фолликулогенеза или же схемы стимуляции суперовуляции. Цитируемая выше работа является фактически единственной публикацией, в которой обоснован метод отбора эмбрионов по темпам развития для повышения частоты наступления беременности в программе ЭКО. Явление ранней компактизации эмбрионов в культуре еще детально не было проанализировано в литературе. Не изученным остается основной вопрос – что представляют собой такие эмбрионы? Является ли их ранняя компактизация отражением ускоренных темпов дробления или же это процесс, связанный со спецификой развития эмбрионов в условиях культуры? Тем не менее в большинстве программ ЭКО при наличии таких эмбрионов их, как правило, отбирают для переноса в полость матки. В связи с этим нами в настоящей работе были проанализированы факторы, влияющие на появление в программе ЭКО эмбрионов с ранней компактизацией (через 66 ч после инсеминации ооцитов). Возраст женщины и ответ яичника на стимуляцию суперовуляции (число пунктированных фолликулов) не оказывали влияния на частоту ранней компактизации эмбрионов в культуре. В то же время такие показатели спермограммы мужа, как доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов, морфологически нормальных клеток и доля сперматозоидов с легкой патологией, были выше в группе женщин, у которых отмечены эмбрионы с ранней компактизацией. В этой же группе оплодотворяющая способность сперматозоидов мужа также была выше. Это проявилось в том, что при равном числе пунктированных фолликулов и ооцитов, число зигот, а также число полученных и перенесенных эмбрионов у женщин с компактизацией эмбрионов было достоверно выше, чем у женщин, у которых это явление не отмечено. Таким образом, на появление через 66 ч после инсеминации ооцитов эмбрионов на стадии компактизации влияет характер сперматогенеза. В настоящей работе показано, что явление ранней компактизации отмечается в популяции более динамично развивающихся эмбрионов, имеющих лучшие морфологические характеристики. Наличие компактизованных эмбрионов в числе перенесенных в полость матки не оказывает влияния на частоту наступления беременности, однако в этом случае обнаружена тенденция к повышению частоты многоплодия в подгруппе беременных женщин. В литературе показано, что такое явление, как раннее дробление, не зависит от клинических показателей сперматогенеза и фолликулогенеза [7]. По нашим данным, на процесс ранней компактизации эмбрионов человека в культуре влияет характер сперматогенеза. Выводы Возраст женщины и ответ яичника на стимуляцию суперовуляции (число пунктированных фолликулов) не оказывают влияния на частоту ранней компактизации эмбрионов в культуре. На процесс ранней компактизации эмбрионов человека в культуре влияет характер сперматогенеза. О.А. Воробьева, О.А. Леонтьева, А.А. Кирсанов Институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Международный центр репродуктивной медицины, Санкт-Петербург Литература 1. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Москва, Наука, 1988. 2. Weima S.M. The culture of embryos. In: IVF LAB. Laboratory aspects of in vitro fertilization. Ed.: M.Bras, J.W.Lens, M.H. Piederiet. N V Organon 1996; 111–126. 3. Dale B., Talevi R., Gualtiere R. Intercellular communication in the early human embryo. Mol Reprod Dev 1991; 29: 22– 28. 4. Trounson A.O., Mohr L.R., Wood C., Leeton J.F. Effect of delayed insemination on in vitro fertilization, culture and transfer of human embryos. J Reprod Fertil 1982; 64: 285–294. 5. Balakier H., Mac Lusky N.J., Casper R.F. Characterization of the first cell cycle in human zygotes: implication for cryopreservation. Fertil Steril 1993; 59: 359–365. 6. Capmany G., Taylor A., Braude P.R., Bolton V.N. The timing of pronuclear formation, DNA synthesis and cleavage in the human 1-cell embryo. Mol Hum Reprod 1996; 2: 299–306. 7. Shoukir Y., Campana A., Farley T., Sakkas D. Early cleavage of in vitro fertilized human embryos to the 2-cell: a novel indicator of embryo quality and viability. Hum Reprod 1997; 12: 1531–1536. 8. Воробьева О.А., Леонтьева О.А., Корсак В.С. Влияние морфологии сперматозоидов на частоту оплодотворения и нарушение раннего эмбрионального развития. Цитология 1996; 38: 12. 9. Воробьева О.А., Леонтьева О.А., Корсак В.С. Методы оценки морфологии сперматозоидов и их прогностическое значение в программе ЭКО. Пробл репрод 1995; 3. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||