Новый метод объективного и быстрого определения основных показателей фертильности спермы

Интерес, возросший за последнее время к проблеме мужского бесплодия, обусловлен высокой частотой нарушений репродуктивной функции мужчин, составляющей в бесплодном браке 40–50%. Важнейшим методом в оценке функционального состояния половых желез и суждении о плодовитости мужчин является исследование спермы. В связи с этим, выявление мужского фактора при обследовании бесплодных пар в большой степени зависит от точного и корректного определения показателей подвижности и концентрации сперматозоидов в семенной жидкости [1, 2]. Эти данные являются основными дискриминационными показателями и решающими в оценке ее фертильности [3, 4]. Признание значимости объективного определения характеристик подвижности клеток привело к созданию различных методических подходов и устройств, позволяющих вычислять их подвижность и концентрацию. Среди них, имеющие приоритетное значение, компьютерные системы анализа семенной жидкости, включающие микроскоп и видеокамеру с цифровой обработкой изображений. Эти устройства являются весьма дорогостоящими и требуют применения сложных алгоритмов обработки больших массивов данных [5, 6]. Высокая стоимость приборов, большая продолжительность выполнения анализа и не всегда отвечающая полным требованиям оценки анализа воспроизводимость результатов являются постоянными объектами критики таких систем. К разряду нетрудоемких и недорогих подходов, позволяющих быстро провести качественный анализ спермы, относится определение коэффициента подвижности сперматозоидов [7]. Метод регистрирует флуктуации оптической плотности, вызванные движением сперматозоидов через тонкий оптический канал. Частота этих флуктуаций коррелирует с концентрацией подвижных клеток и интенсивностью их движения, что используется для вычисления коэффициента подвижности сперматозоидов. Однако, вопрос применимости этого параметра в клинической практике остается открытым. Также нерешенными остаются вопросы стандартизации измерений. Это в первую очередь касается температурного режима, типа камеры и состава среды для разведения образцов. Развитие оптических методов позволило создать новые подходы к оценке характеристик подвижности сперматозоидов. Для определения основных показателей фертильности спермы в неразбавленном эякуляте нами был разработан принципиально новый метод. Он позволяет регистрировать концентрацию, суммарную подвижность, количество активно подвижных и среднюю скорость сперматозоидов. Целью настоящей работы явилось изучение возможности применения нового метода и разработанного спермоанализатора для оценки качества спермы в сравнении с данными, полученными при использовании камеры Маклера в оптическом микроскопе. Материал и методы Проведено исследование спермы у 74 мужчин, состоящих в бесплодном браке с нормо- и патозооспермией. Клинико-лабораторное исследование выполняли под контролем врача-андролога. Для интерпретации полученных результатов и оценки их информативности использовали данные, изложенные в Руководстве ВОЗ по лабораторному исследованию спермы человека и взаимодействию с цервикальной жидкостью, рекомендованные для практического применения (1992 г.). Анализ спермы осуществляли при половом воздержании не менее 3-х дней и не больше 7 дней. Сбор спермы производили в стерильный пластмассовый контейнер, ранее проверенный на токсичность к сперматозоидам. Все манипуляции с хранением и транспортировкой образцов осуществляли при температуре 22–26°С. Исследование спермы выполняли в камере Маклера при 200-кратном увеличении микроскопа в течение 1 часа после сбора образца. Скорость движения клеток определяли по времени, необходимому для преодоления расстояния 0,1 мм. Образцы спермы параллельно исследовали с помощью разработанного нами устройства, принципиальная схема которого показана на рис. 1а. Хорошо перемешанная проба с помощью микропипетки объемом 50 микролитров помещалась в специальную стеклянную камеру, где под действием капиллярных сил она заполняла рабочий объем. При движении клеток в камере возникали периодические колебания оптической плотности с частой, соответствующей скорости перемещения клеток и периоду модуляции интенсивности света (рис. 1б). Колебания интенсивности света, которые регистрировались фотоприемником, поступали в аналого-цифровой преобразователь и далее в компьютер. Так как интенсивность света вдоль рабочей поверхности камеры была модулирована периодической функцией с периодом модуляции 15 мкм, то после спектрального анализа сигнала по его мощности в соответствующем диапазоне частот вычисляли количество клеток, имеющих определенную скорость. Анализ флуктуаций оптической плотности, вызванных движением клеток через оптический канал, позволил вычислить их концентрацию в образце. Как известно, этот принцип использовался ранее для определения концентрации клеток крови [8]. Рис. 1.а. Схема прибора. Рис. 1.б. Схема прибора. Анализ спермы проводили в специальной камере, температура которой поддерживалась при 37°С. Для свободного движения сперматозоидов в камере и создания возможности регистрации гиперактивных клеток глубина камеры была выбрана достаточно большой (200 мкм). Так как в основном клетки двигались параллельно стенкам, то корректировать результаты анализа их подвижности с учетом третьего измерения, то есть перпендикулярно стенкам камеры, не требовалось. Концентрацию сперматозоидов определяли в млн/мл, а подвижность в % от их общего числа, как это принято в руководстве ВОЗ (1992 г.). Устройство надежно фиксировало параметры сперматозоидов в широком диапазоне концентраций (2–250 млн/мл). При этом регистрировались сперматозоиды, имеющие скорость движения 2–150 мкм/сек, а общее время измерения составляло 4,5 минуты. Определяемые величины представлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение. Для оценки корреляции между стандартными методами анализа и показаниями прибора использовался непараметрический анализ Пирсона. Результаты и обсуждение Существует большое разнообразие факторов, прямо или косвенно влияющих на точность того или иного метода диагностики. В связи с этим, создание новых технологий предусматривает не только исследование стандартизированных методик, но и повышение контроля качества и точности проводимых процедур, позволяющих дать возможность накапливать и сопоставлять информацию. Примером этого является прогресс в области исследования спермы. С момента первого издания Руководства ВОЗ по лабораторной оценке спермы в 1980 г. были предложены и модернизированы на более простые и удобные различные тесты диагностики спермы: от специализированных гемоцитометрических камер (R.Neubauer и А.Makler) до современных автоматических компьютерных систем (CASA). Естественно, каждое такое устройство не может быть «идеальным», и все зависит от того, какую задачу ставит исследователь перед данной системой. Разрабатывая новый методический подход для анализа спермы, авторы исходили из задачи создания простого и удобного метода, преимуществом которого была бы высокая точность и воспроизводимость получаемых результатов в широком диапазоне концентраций клеток, характерных для нативного эякулята. Нами обследовано 74 мужчины, состоящих в бесплодном браке в возрасте от 21 до 42 лет. Распределение пациентов в зависимости от принятых характеристик спермограмм следующее: нормозооспермия 45%, астенозооспермия 18%, олигозооспермия 14%, олигоастенозооспермия 12%, тератозооспермия 7%, азооспермия 4%. Результаты определения концентрации сперматозоидов в камере Маклера и в спермоанализаторе показаны на рис. 2. Коэффициент корреляции Спирмана равен 0,97 (n=74, р меньше 0,001), что говорит о хорошем соответствии показаний нового метода общепринятому с помощью микроскопа. Несколько меньшее соответствие результатов двух методов наблюдалось при определении подвижности клеток. Коэффициент корреляции Спирмана составил 0,62 (n=74, р меньше 0,001) для подвижных сперматозоидов категории А+Б и 0,73 (n=74, р меньше 0,001) для активно подвижных клеток категории А. Однако, новый метод регистрировал более высокую подвижность клеток в образцах, чем это получалось при исследовании с помощью микроскопа (44% и 32% для категории А+Б, 11% и 9% для категории А соответственно). Вероятно, это связано с тем, что в наших экспериментах поддерживалась стабильная и более высокая температура камеры 37°С, чем при исследовании с помощью микроскопа при температуре помещения 22–26°С. Рис. 2. Результаты определения концентрации сперматозоидов в камере Маклера и в спермоанализаторе. Для изучения зависимости получаемых результатов от соотношения подвижных и неподвижных клеток в пробе использовали ряд разведений образцов спермы с нормальными показателями подвижности сперматозоидов. Для этого образец разделяли на две равные части, где одну пробу хранили при температуре 22–26°С, а вторую подвергали воздействию высокой температуры (60°С) в течение 5 минут, что вызывало прекращение двигательной активности сперматозоидов. Затем аликвоты нативного эякулята смешивали с обездвиженными клетками в разных пропорциях и исследовали с помощью спермоанализатора. Результаты этого эксперимента приведены на рис. 3, где данные представлены в виде среднего ± среднеквадратичного отклонения в 5 измерениях. Как следует из рисунка, метод регистрирует линейную зависимость подвижности сперматозоидов от степени разбавления неподвижными клетками при сохранении одинаковой концентрации. Рис. 3. Изменение показателей эякулята по данным спермоанализатора в зависимости от степени его разведения неподвижными аутологичными сперматозоидами. D – концентрация (млн/мл), Ё – % подвижных, О – % активно подвижных. Также проведено исследование на спермоанализаторе показателей эякулята в зависимости от степени его разведения семенной жидкостью, лишенной сперматозоидов. В связи с чем для изменения количества клеток в пробе образец делили на две равные части. Один объем хранили при температуре 22–26°С, второй центрифугировали при 1000xg в течение 10 мин для получения бесклеточного супернатанта. Аликвоты нативного эякулята смешивали с бесклеточным эякулятом в разных пропорциях и определяли показатели полученных проб с помощью спермоанализатора. Анализ данных показал, что новый метод регистрирует линейное уменьшение концентрации сперматозоидов в зависимости от степени разбавления, в то время как процентный состав подвижных и активно подвижных клеток сохраняется практически неизменным. Рис. 4. Изменение показателей эякулята по данным спермоанализатора в зависимости от степени его разведения семенной жидкостью без сперматозоидов. D – концентрация (млн/мл), Ё – % подвижных, О – % активно подвижных. Результаты проведенных исследований нативного эякулята и выполненных специальных экспериментов для доказательства точности определения основных показателей сперматозоидов свидетельствуют, что предложенный прибор адекватно и корректно регистрирует концентрацию и подвижность сперматозоидов. К достоинствам метода относится возможность исследования спермы в неразбавленной среде, высокая точность и воспроизводимость получаемых результатов, а также простота и небольшое время проведения анализа. Использование такого методического подхода в клинической практике позволит быстро и точно оценивать основные дискриминационные параметры спермы и выявлять мужской фактор бесплодия, что в дальнейшем поможет определить тактику ведения бесплодной пары. Несомненным достоинством прибора является возможность его использования в лабораториях вспомогательных методов репродукции. З.А. Габбасов*, Г.В. Тер-Аванесов** Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ*, Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН*, Москва Литература 1. Blasco L. Clinical tests of sperm fertilizing ability. Fertil Steril 1984; 41: 177. 2. Dohlberg В. Sperm motility in fertile men and males in infertile units: in vitro test. Arch Androl 1988; 20: 509. 3. Mulligan M.P., Harris S., Dannis K.J. Comparison of sperm velocity in fertile and infertile groups as measured by time-lapse photography. Fertil Steril 1980; 34: 509. 4. Hinting A., Comhair F., Schoonjans F. Capacity of objectively assessed sperm motility characteristics in differentiating between semen of fertile and subfertile men. Fertil Steril 1988; 50: 635. 5. Knuth U.A., Yeung C.H., Nieschlag E. Computerized semen analysis: objective measurement of semen characteristics is biased by subjective parameter setting. Fertil Steril 1987; 48: 118. 6. Vantman D., Banks S.M., Koukoulis G., Dennison L., Sherins R.J. Assessment of sperm motion characteristics from fertile and infertile men using a fully automated computer-assisted semen analyzer. Fertil Steril 1989; 51: 156. 7. Bartoov В., Sneider М., Ben-Barak J., Yogev L., Mayevsky A., Lightman A. Sperm motility index: a new parameter for human sperm evaluation. Fertil Steril 1991; 56: 108. 8. Gabbasov Z.A., Gavrilov I.Yu., Popov E.G. The use of optical density fluctuations for determination of platelet concentration in stirred suspension. Platelets 1992; 3: 281.