Нарушение продукции плацентарных белков (ТБГ, ПАМГ-2) как фактор бесплодия у женщин

После открытия в 1970 г. Ю.С. Татариновым и В.Н. Масюкевичем [1] трофобластспецифического b-гликопротеина (ТБГ) начался новый этап в изучении белков репродуктивной системы человека. Основное практическое значение имеют ТБГ [2–5] и плацентарный a2-микроглобулин (ПАМГ-2) [6–9]. Синтез ТБГ у небеременных женщин осуществляется в железах эндометрия и эпителии маточных труб [5]. Получены убедительные данные об иммуносупрессивной активности ТБГ [10, 11]. В дальнейших исследованиях дано теоретическое обоснование возможности применения ТБГ в качестве иммуномодулирующего фактора при терапии патологии беременности. Вопрос о содержании ТБГ в крови и других биологических жидкостях при бесплодии не получил достаточного освещения в литературе. Имеются лишь единичные сообщения о повышении уровня ТБГ в периферической крови у бесплодных женщин с «запущенным» эндометриозом [5]. Синтез ПАМГ-2 у небеременных женщин осуществляется железистыми эпителиальными клетками эндометрия и мерцательным эпителием маточных труб [12–14]. Содержание ПАМГ-2 исследовано в разных биологических средах: у женщин – в периферической и менструальной крови, у мужчин – в периферической крови и сперме. Выявлена связь между уровнем ПАМГ-2 и характером менструальной функции у женщин, а также нормальной и нарушенной генеративной функцией в супружеской паре. Имеются отдельные данные литературы о повышении содержания ПАМГ-2 в сыворотке крови в периовуляторный период при распространенных формах эндометриоза [15]. Таким образом, имеющиеся данные литературы носят фрагментарный характер и не позволяют сделать вывод об общих закономерностях изменения концентрации белков репродуктивной системы и их роли в патогенезе бесплодия. В связи с этим нами изучено содержание ТБГ и ПАМГ-2 в перитонеальной жидкости и их значение в репродуктивной функции женщин в норме и при наружном генитальном эндометриозе. Методы Обследованы 32 молодые женщины с нормальной репродуктивной функцией (23 – с отсутствием патологии внутренних половых органов и 9 – с наличием наружного генитального эндометриоза) и 73 пациентки с нарушенной репродуктивной функцией и наружным генитальным эндометриозом. Пробы перитонеальной жидкости у женщин получены при проведении лапароскопии, образцы спермы – от здоровых мужчин при обследовании в Перинатальном центре Ивановского НИИ материнства и детства Минздрава России. В контрольной группе женщин лапароскопия производилась с целью стерилизации по социальным показаниям. В остальных случаях операция была выполнена с диагностической и лечебной целями. В перитонеальной жидкости определяли содержание ТБГ, ПАМГ-2 методом иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Диагност» (Москва). Фагоцитарная активность макрофагов перитонеальной жидкости исследована у 18 женщин (у 6 – здоровых, у 2 – с наружным генитальным эндометриозом). Для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов осуществляли их кратковременное культивирование в присутствии сперматозоидов в соответствии с методикой [11]. Процедура исследования включала следующие этапы: 1) взятие перитонеальной жидкости; 2) адгезия макрофагов к стеклу; 3) культивирование макрофагов в присутствии суспензии сперматозоидов; 4) промывание средой 199 для удаления нефагоцитированных и неадгезированных сперматозоидов и эритроцитов; 5) фиксация в 1% растворе глутарового альдегида («Fluka», Швейцария) в среде 199 (рН 7,4) в течение 24 ч; 6) окраска препаратов по Романовскому, заключение в среду «DPX mountant» («BDH», Великобритания) и дифференцированный подсчет клеток. При исследовании препаратов осуществляли дифференцированный подсчет макрофагов с выделением следующих функциональных классов клеток: 1) нефагоцитирующие макрофаги; 2) макрофаги, фагоцитирующие 1 сперматозоид; 3) макрофаги, фагоцитирующие 2 сперматозоида и более; 4) макрофаги, фагоцитирующие эритроциты. Исследовано влияние концентрации ТБГ в культуральной среде в концентрациях 0,6, 1,5 и 3,0 мкг/мл; антисыворотки к ТБГ в количестве 0,02, 0,05 и 0,1 мл соответственно; ПАМГ-2 – в концентрации 25 и 75 мкг/мл на процесс фагоцитоза сперматозоидов. Препараты белков с чистотой около 75 % получены на кафедре биохимии (зав. – проф. Ю.С. Татаринов) Российского государственного медицинского университета. Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационного анализа с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты Изучение содержания ТБГ в перитонеальной жидкости показало отсутствие статистически достоверных различий показателей этого белка в динамике менструального цикла в обследованных группах женщин. В группе здоровых женщин (контроль) содержание ТБГ составило в I фазе менструального цикла 8,29±4,24 нг/мл, во II фазе – 2,17±1,30 нг/мл (в среднем 6,45±3,06 нг/мл). В группе фертильных женщин с наличием наружного генитального эндометриоза среднее содержание ТБГ не отличалось от такового в контрольной группе и составило 7±2,62 нг/мл. В группе женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, уровень ТБГ был увеличен как в I фазе (до 18,8±4,01 нг/мл), так и во II фазе менструального цикла (до 15,09±3,53 нг/мл). У этих женщин средние показатели ТБГ во II фазе цикла были в 7 раз выше по сравнению с таковыми в контрольной группе (р меньше 0,01). Средняя концентрация ТБГ составила 16,96±2,68 нг/мл и была достоверно выше по сравнению с таковой у женщин с нормальной репродуктивной функцией (р меньше 0,05). Концентрация ТБГ в перитонеальной жидкости у женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, прогрессивно возрастает по мере увеличения распространенности патологического процесса. Так, средняя концентрация ТБГ у женщин с I степенью эндометриоза составляла 8,60±4,98 нг/мл. Уровень белка у женщин со II степенью эндометриоза в 1,9 раза выше по сравнению с I степенью. Средние значения ТБГ у пациенток с III–IV степенью эндометриоза заболевания по сравнению с больными I и II степенью больше в 2,5 и 1,4 раза соответственно. Концентрация этого протеина у женщин со II и III–IV степенью заболевания достоверно выше, чем в контрольной группе (р меньше 0,05). При ретроспективном анализе с учетом результатов лечения обнаружено, что восстановление репродуктивной функции у женщин с эндометриозом происходило при более высоких показателях ТБГ в перитонеальной жидкости (21,20±5,48 нг/мл) в сравнении с контрольной группой (р меньше 0,05). Содержание ПАМГ-2 в перитонеальной жидкости статистически достоверно различалось в динамике менструального цикла у обследованных женщин. В контрольной группе оно составило в I фазе менструального цикла 33,8±12,6 нг/мл, во II фазе – 43,5±25,4 нг/мл (в среднем 36,72± 11,66 нг/мл). В группе фертильных женщин с наличием наружного генитального эндометриоза средняя концентрация ПАМГ-2 (31,11±10,55 нг/мл) не отличалась от таковой в контрольной группе. В группе женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, содержание ПАМГ-2 составляло в I фазе менструального цикла 41,0±6,05 нг/мл, во II фазе – 28,9±3,92 нг/мл (в среднем 35,04±3,70 нг/мл). Концентрация ПАМГ-2 в перитонеальной жидкости у женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, достоверно не изменяется по мере увеличения распространенности патологического процесса. Однако выявлено достоверное снижение частоты встречаемости индивидуальных показателей ПАМГ-2 ( меньше 30 нг/мл) у женщин с наружным генитальным эндометриозом III–IV степени (в 35,3% случаев) по сравнению с контрольной группой (р меньше 0,05). При проведении ретроспективного анализа результатов лечения у пациенток этой группы не выявлено достоверных различий в средних значениях ПАМГ-2 в перитонеальной жидкости. Учитывая наши данные о значительном повышении содержания ТБГ в перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом и данные об иммуномодулирующем действии ТБГ и ПАМГ-2, мы изучили влияние этих белков на процесс фагоцитоза сперматозоидов перитонеальными макрофагами. Установлено, что ТБГ оказывает дозозависимое тормозящее воздействие на процесс фагоцитоза: фагоцитарная активность макрофагов снижается в 2–4 раза (рис. 1). Для доказательства специфичности ингибирующего действия ТБГ на фагоцитоз сперматозоидов перитонеальными макрофагами in vitro нами исследовано влияние на этот процесс антител к ТБГ. Выявлено значительное увеличение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Это увеличение было дозозависимым и составило по разным показателям от 1,5 до 4 раз (рис. 2). Рис. 1. Влияние ТБГ на функциональную активность перитонеальных макрофагов. Здесь и на рис. 2: а – число макрофагов, фагоцитирующих 1 сперматозоид; б – число макрофагов, фагоцитирующих 2 сперматозоида и более; в – число макрофагов, фагоцитирующих эритроциты; г – число нефагоцитирующих макрофагов. Звездочками отмечено достоверное отличие результата по сравнению с контрольной группой: * – р меньше 0,05; ** – р меньше 0,01; *** – р меньше 0,001. Рис. 2. Влияние антисыворотки к ТБГ на функциональную активность перитонеальных макрофагов. Препарат ПАМГ-2 не оказывал влияния на функциональную активность перитонеальных макрофагов. Обсуждение Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что в динамике менструального цикла отсутствуют различия показателей специфических плацентарных белков. Перитонеальная жидкость здоровых женщин в среднем содержит 6,45 нг/мл ТБГ, 36,72 нг/мл ПАМГ-2. У фертильных женщин с наличием наружного генитального эндометриоза не выявлено достоверных различий этих показателей по сравнению с контрольной группой. У женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, в сравнении с контрольной группой обнаружено увеличение концентрации ТБГ в целом и в динамике менструального цикла. Следует отметить, что информативность исследования концентрации плацентарных белков в перитонеальной жидкости различается в разные фазы менструального цикла. Так, концентрация ПАМГ-2 у женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, повышена в сравнении со здоровыми женщинами только в I фазе менструального цикла. Учитывая данные о способности ПАМГ-2 нарушать взаимодействие сперматозоидов и яйцеклетки [16, 17], можно предположить участие этого механизма в развитии бесплодия при эндометриозе. При прогрессировании заболевания происходит повышение содержания ТБГ в перитонеальной жидкости. Это увеличение более значительно при III и IV степени заболевания. На последних стадиях заболевания информативным является и повышенное содержание ПАМГ-2. Показатели специфических плацентарных белков в перитонеальной жидкости при изученных формах бесплодия имеют определенную прогностическую значимость. Так, в группе женщин с бесплодием, обусловленным наружным генитальным эндометриозом, вероятность наступления беременности тем выше, чем больше средняя концентрация ТБГ в перитонеальной жидкости. В наших исследованиях обнаружено прямое ингибирующее действие ТБГ на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в отношении гетерологичных сперматозоидов in vitro. С учетом этого можно предположить, что увеличение концентрации ТБГ в перитонеальной жидкости является одним из механизмов ингибирования фагоцитоза гетерологичных сперматозоидов перитонеальными макрофагами in vivo. Таким образом, представленные данные свидетельствуют о высокой информативности исследования содержания специфических плацентарных белков в перитонеальной жидкости и обосновывают целесообразность использования препарата ТБГ с целью подавления фагоцитоза сперматозоидов в комплексной терапии нарушения репродуктивной функции женщин. Л.В. Посисеева, А.О. Назарова Кафедра акушерства и гинекологии Ивановской государственной медицинской академии; Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава Российской Федерации Литература 1. Татаринов Ю.С., Масюкевич В.Н. Иммунохимическая идентификация нового бета-1-глобулина в сыворотке крови беременных женщин. Бюлл экспер биол 1970; 6: 66. 2. Александров Л.С., Размахина Н.И., Побединский Н.М., Платонова Т.К. Содержание трофобластического бета-гликопротеина в сыворотке крови при нормальной беременности и нефропатии. Акуш и гинек 1994; 2: 47–48. 3. Александров Л.С. Особенности динамики содержания трофобластического b-гликопротеина в сыворотке крови беременных при физиологической беременности и при гестозах. Современные проблемы диагностики и лечения нарушений репродуктивного здоровья женщины: Сб. тр. I Северо-Кавказ. Съезда акушеров-гинекологов; 7–8 сент. 1994 г. Ростов-на-Дону, 1994; 132. 4. Петрунин Д.Д., Грязнова И.М., Петрунина Ю.А., Татаринов Ю.С. Иммунохимическая идентификация органоспецифического альфа-2-глобулина плаценты человека и его содержание в амниотической жидкости. Бюл Эксп мед биол 1976; 7: 803–804. 5. Seppala M.,„ Koistenen R., Piitinen L. et al. Molecular biology and clinical application of proteins of the female genital tract. Hum Reprod «Abstr. 2nd Jt Meet. ESHRE and ESCO». 1990; 1: 20. 6. Олефиренко Г.А., Татаринов Ю.С., Щербакова Л.А., Петрунин Д.Д. Серологические исследования альфа-2-микроглобулина фертильности у женщин с нормальным и ановуляторным менструальным циклом. Акуш и гинек 1988; 8: 20–22. 7. Петрунин Д.Д., Татаринов Ю.С., Щербакова Л.А. и др. Содержание альфа-2-микроглобулина фертильности у женщин с нормальным менструальным циклом и на ранних стадиях беременности. Вопр охр мат и дет 1988; 2: 50–52. 8. Fay T.N., Jacobs I.J., Teisner B. et al. A biochemical test for the direct assessment of endometrial function: measurement of the major secretory endometrial protein PP-14 in serum during menstruation in relation to ovulation and luteal function. Hum Reprod 1990; 1.5: 4: 382–386. 9. Julkunen M., Apter D„., Seppala M. et al. Serum levels of placental protein 14 reflect ovulation in nonconceptional menstrual cycles. Fertil Steril 1985; 45: 1: 47–50. 10. Татаринов Ю.С., Головистиков И.Н., Горлина Н.К. Влияние трофобластического бета-1-гликопротеина на пролиферацию лимфоцитов в культуре, вызванную митогенными и аллогенными кетками. Иммунология 1980; 5: 14–17. 11. Bohn H., Winder W. Isolation and characterization of four new placental tissue proteins (PP18, PP19, PP20, PP21). Archs Gynec 1985; 236: 235–242. 12. Петрунин Д.Д., Козляева Г.А., Меснянкина Н.В., Шевченко О.П. Обнаружение хорионического альфа-2-микроглобулина в эндометрии в секреторной фазе менструального цикла и в сперме мужчин. Акуш и гинек 1980; 3: 22–23. 13. Julkunen M., Wahlstrom Т., Seppala M. Human fallopian tube contains placental protein 14. Amer J Obstetr Gynecol 1986; 154: 5: 1076–1079. 14. Riittinen L., Stenman U.H., Alfthan H. et al. Time-resolved immunofluorometric assay of placental protein 14. Clin Chim Acta 1989; 183: 115–124. 15. Telimaa S., Kauppila, Ronnberg L. et al. Elevated serum levels of endometrial secretory protein PP 14 in patients with advanced endometriosis. Suppression by treatment with danazol and high-dose medroxyprogesterone acetate. Am J Obstet Gynecol 1989; 161: 4: 866–871. 16. Dell A., Morris H.R., Easton R.L. et al. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycodelin, a human glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activites. J Biol Chem 1995; 270: 41: 24116–24126. 17. Oehninger S., Coddington C.C., Hodgen G.D., Seppala M. Factors affecting fertilization: endometrial placental protein 14 reduces the capacity of human spermatozoa to bind to the human zona pellucida. Fertil Steril 1995; 63: 2: 377–383.