Сравнительный анализ морфологии сперматозоидов человека.
|
В отличие от других млекопитающих для человека характерен высокий уровень морфологической гетерогенности сперматозоидов. Было показано, что морфологически аномальные сперматозоиды обладают рядом биологических особенностей, понижающих их оплодотворяющую способность. В частности, они имеют более низкую по сравнению с нормальными клетками способность к пенетрации лишенных блестящей оболочки ооцитов хомяка [1], меньшую скорость прямолинейного движения и частоту биения хвоста [2, 3]. У морфологически аномальных клеток изменена реакция гиперактивации при капацитации, а также акросомальная реакция [4]. Также у них чаще отмечаются аномалии хроматина [5], а при некоторых формах патологии головки наблюдается повышение уровня структурных хромосомных аберраций [6], что может оказывать влияние на последующее развитие эмбрионов.
Изучению взаимосвязи морфологии сперматозоидов с мужским бесплодием в настоящее время посвящено большое число работ. Несмотря на то, что полученные данные достаточно противоречивы [7], влияние повышения в эякуляте доли аномальных сперматозоидов на снижение частоты наступления беременности показано как в условиях естественного зачатия [8], так и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий: методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [9–11] и внутриматочной инсеминации [12]. В программе ЭКО, позволяющей количественно проанализировать взаимосвязь различных параметров с мужским бесплодием, установлено, что морфология сперматозоидов, оцененная в соответствии с жесткими критериями нормы, разработанными Крюгером и соавторами [10, 11], является важным прогностическим признаком для оценки вероятности оплодотворения в культуре, а также частоты наступления беременности. Поэтому, одним из направлений оптимизации программы ЭКО является разработка методов, позволяющих с наибольшей эффективностью выделить из эякулята фракцию прогрессивно подвижных сперматозоидов, используемую для инсеминации ооцитов, которая имела бы наилучшие показатели кинематики и морфологии. В большинстве лабораторий для получения подвижной фракции используется метод всплытия (swim-up), либо фракционирование эякулята в градиенте плотности перколла. Применение перколла позволяет более полно выделить из нативного эякулята прогрессивно подвижные сперматозоиды [13, 14]. В то же время популяция сперматозоидов, полученная при использовании метода всплытия, характеризуется лучшими кинематическими параметрами [13, 15]. Относительно того, какой из способов выделения фракции подвижных клеток в большей степени повышает долю морфологически нормальных сперматозоидов, нет единого мнения. Имеются указания как на преимущества использования перколла [16], так и всплытия [13], а также равную эффективность этих методов [15]. В данной работе нами была использована комбинированная методика выделения фракции прогрессивно подвижных форм, которая заключалась в последовательном применении центрифугирования в перколле и дальнейшего всплытия сперматозоидов из полученного осадка. Эта модификация позволяет сочетать преимущества обеих методик [13]. В частности, ранее нами было показано, что при этом эффективно повышается доля сперматозоидов с нормальной структурой хроматина [17]. В настоящей работе исследовано изменение морфологических параметров мужских половых клеток при выделении прогрессивно подвижной фракции комбинированным способом. Следует отметить, что основной методической сложностью такого рода исследований является как отсутствие единого морфометрического стандарта нормального сперматозоида, так и универсальной схемы классификации морфологических патологий. Традиционно каждый аномальный сперматозоид относят к определенному единственному типу патологии. Такая классификация не позволяет объективно описать популяцию клеток, в связи с тем, что некоторые сперматозоиды могут иметь несколько аномалий одновременно. В данной работе нами использован как стандартный подход к оценке морфологии (основанный на критериях нормы, предложенных Крюгером и соавторами [10, 11], и разработанной нами системе классификации аномалий), так и новый подход, позволяющий количественно описать весь спектр наблюдаемых аномалий даже при наличии у сперматозоида сочетанной патологии. Цель данной работы состояла в том, чтобы, используя различные методы оценки морфологии, исследовать изменение соотношения различных морфологических типов сперматозоидов при выделении из нативного эякулята фракции подвижных форм комбинированным способом. Материал и методы Сравнительный анализ морфологии сперматозоидов нативного эякулята и прогрессивно подвижной фракции проведен на образцах спермы, полученных у 57 пациентов, проходивших обследование по поводу бесплодия. У 30 пациентов показатели спермограммы соответствовали норме, в одном случае выявлена олиго-, в 22 – астено- и в 4 – олигоастенотератозооспермия. Выделение из нативного эякулята фракции прогрессивно подвижных форм осуществляли в изотоническом 90% перколле, приготовленном по методике Кохена [18], с последующим проведением процедуры всплытия. Морфологию сперматозоидов оценивали при увеличении 1000 по тотальным, окрашенным гематоксилин-эозином препаратам. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина ее составляет 5–6 мк, ширина 2,5–3,5, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста и срединного отдела. Пограничные формы (сперматозоиды с легкой патологией) имеют слегка удлиненную головку диаметром 2–2,5 мк или небольшие утолщения в области шейки при нормально выраженном акросомальном участке. В данной работе морфология сперматозоидов была проанализирована с помощью двух различных методических подходов: 1. При использовании первого – стандартного метода, каждый сперматозоид относили к определенному, только одному, морфологическому типу в соответствии с классификацией, проиллюстрированной на рис. 1. При этом частоты всех морфологических типов сперматозоидов для каждого конкретного случая в сумме составляют 100%. 2. В соответствии со вторым методом при наличии у сперматозоида множественных патологий фиксировали каждую аномалию отдельно, относя такие клетки к нескольким морфологическим типам. В данном случае сумма частот всех типов аномалий, морфологически нормальных и пограничных сперматозоидов может превышать 100%. Подсчитывали также и долю сперматозоидов с сочетанной патологией. Такой подход дает возможность проанализировать частоту встречаемости всех типов аномалий, позволяя в каждом конкретном случае составить более объективное представление о спектре морфологических патологий, характерном для популяции сперматозоидов. Рис. 1. Схема классификации морфологии сперматозоидов.
Относительное (в процентах от исходной величины) изменение частот встречаемости различных морфологических типов сперматозоидов рассчитывали по формуле: (А1–А0)х100% А0 где А0 – частота встречаемости клеток определенного типа в нативном эякуляте, А1 – соответствующее значение для фракции прогрессивно подвижных сперматозоидов. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием методов корреляционного и множественного регрессионного анализа, а также td-критерия Стьюдента для совокупностей с попарно связанными вариантами. Результаты При анализе изменения доли различных морфологических типов сперматозоидов в результате выделения фракции прогрессивно подвижных клеток было выявлено значительное повышение доли нормальных и пограничных (с легкой формой патологии) сперматозоидов в подвижной фракции по сравнению с нативным эякулятом (43,1±2,1 и 21,6±1,5 p меньше 0,0001; 12,6±0,4 и 9,3±0,5 p меньше 0,0001 соответственно) (табл. 1). Относительный прирост частоты встречаемости нормальных сперматозоидов составил в среднем 128,8±9,7%, доли пограничных клеток 65,0±11,6%, а суммарной доли нормальных и пограничных форм – 104,4±8,3% (рис. 2). Таблица 1. Изменение доли морфологически нормальных и ограничных сперматозоидов при выделении фракции прогрессивно подвижных клеток
Рис. 2. Изменение доли морфологически нормальных, пограничных и суммарной доли нормальных и пограничных сперматозоидов при выделении фракции подвижных клеток.
При оценке изменения спектра морфологических аномалий с использованием второго подхода к анализу морфологии было выявлено достоверное (p меньше 0,0001) снижение в подвижной фракции частот встречаемости всех типов аномалий (табл. 2). Нами показано, что частота встречаемости патологий хвоста уменьшалась относительно исходной величины в среднем на 84,9±1,6%, акросомальной области – на 37,9±4,3% (при этом доля клеток без акросом снижалась на 40,7±8,5%, а доля сперматозоидов с акросомой уменьшенного размера – на 20,5±5,7%), аномалий формы ядра – на 42,2±5,2%, незрелых форм – на 92,4±4,5%, патологий шейки и срединного отдела – на 38,6±7,3% (рис. 3). Таблица 2. Изменение частоты различных морфологических аномалий сперматозоидов при выделении фракции прогрессивно подвижных клеток
Примечание. * – p меньше 0,0001 по сравнению с соответствующим показателем в эякуляте. Рис. 3. Изменение частот встречаемости различных типов морфологических аномалий сперматозоидов при выделении из эякулята фракции подвижных клеток.
Изменение доли различных типов аномальных сперматозоидов при выделении из нативного эякулята фракции подвижных форм было изучено также и при использовании стандартного подхода к оценке морфологии. При этом в подвижной фракции по сравнению с нативным эякулятом не было выявлено достоверного изменения доли клеток с уменьшенными размерами акросомальной области, а также с патологией шейки и срединного отдела. Частоты встречаемости сперматозоидов с аномалиями формы ядра, патологией хвоста, отсутствием акросомы, незрелых форм, а также клеток с удвоениями и изменениями размера головки достоверно снижались при выделении подвижной фракции (соответственно на 18,8±8,2%, 84,9±1,6%, 41,7±7,3%, 88,5±8,5, 41,5±9,0% относительно исходного значения) (табл. 3, рис. 4). Таблица 3. Изменение частоты встречаемости различных типов аномальных сперматозоидов при выделении фракции прогрессивно подвижных клеток
Примечание. * – p меньше 0,0001; ** – p меньше 0,01 по сравнению с соответствующим показателем в эякуляте. Рис. 4. Изменение частот встречаемости различных типов аномальных сперматозоидов при выделении фракции подвижных клеток (стандартный подход к оценке морфологии).
Также нами было проанализировано изменение доли клеток с множественными морфологическими аномалиями при выделении прогрессивно подвижной фракции. Исходно в нативном эякуляте данный показатель варьировал в диапазоне от 9 до 68%, составляя в среднем 30,8±1,9%. Среди морфологически аномальных сперматозоидов множественная патология была выявлена у 42,8±1,7% клеток. В различных образцах спермы это значение составляло от 19 до 72%. В результате выделения из нативного эякулята фракции прогрессивно подвижных форм доля клеток с множественными морфологическими аномалиями достоверно снижалась (в среднем до 8,84±1,0%; p меньше 0,0001) (табл. 4). Относительно исходной величины доля клеток, имеющих по две морфологические аномалии, уменьшалась на 67,7±2,9%, по три – на 90,6±2,8%, по четыре и более – на 95,5±4,5%, а суммарная доля клеток с сочетанной патологией снижалась на 72,5±2,4% (рис. 5). В то же время нами не было отмечено изменения частоты встречаемости аномальных сперматозоидов, не имеющих множественных патологий (табл. 4). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при выделении из нативного эякулята прогрессивно подвижной фракции снижение доли аномальных сперматозоидов происходит в основном в результате элиминации клеток с множественными морфологическими патологиями. Таблица 4. Изменение при выделении фракции прогрессивно подвижных форм доли аномальных сперматозоидов с различным числом патологий
Примечание. *– p меньше 0,0001 по сравнению с соответствующим показателем исходно в эякуляте. Рис. 5. Изменение при выделении подвижной фракции доли морфологически аномальных сперматозоидов с различным числом патологии.
Изменение доли нормальных форм в процессе выделения подвижной фракции было проанализировано нами в группах пациентов, имевших исходно от нуля до 14% либо 15% и более нормальных сперматозоидов в эякуляте. Повышение доли нормальных клеток было отмечено нами в обеих группах пациентов (p меньше 0,001). Однако у пациентов первой группы частота встречаемости морфологически нормальных сперматозоидов во фракции подвижных клеток была значительно ниже, чем у пациентов второй группы (28,3±0,4 и 52,5±0,5; p меньше 0,001). С использованием методов множественного регрессионного анализа нами были проанализированы факторы, оказывающие влияние на частоту встречаемости морфологически нормальных сперматозоидов во фракции прогрессивно подвижных форм. Величина данного показателя линейно возрастает (p меньше 0,00001) по мере увеличения доли нормальных форм в нативном эякуляте (рис. 6). Общая концентрация, доля и концентрация прогрессивно подвижных сперматозоидов в эякуляте не оказывают влияния на долю морфологически нормальных клеток в подвижной фракции. Для суммарной доли нормальных и пограничных форм в прогрессивно подвижной фракции характерна аналогичная зависимость (рис. 7). Следовательно, индивидуальные различия, существующие в эякуляте как по доле нормальных сперматозоидов, так и по суммарной доле нормальных и пограничных типов клеток, сохраняются и после выделения фракции прогрессивно подвижных клеток. Рис. 6. Изменение доли морфологически нормальных сперматозоидов при выделении фракции прогрессивно подвижных форм.
Рис. 7. Изменение суммарной доли морфологически нормальных сперматозоидов и сперматозоидов с легкой формой патологии при выделении фракции прогрессивно подвижных клеток.
Обсуждение Данные литературы о влиянии морфологии сперматозоидов на частоту оплодотворения ооцитов в культуре и вероятность наступления беременности в программе ЭКО достаточно противоречивы [7]. Это может быть связано с тем, что традиционно морфология сперматозоидов оценивается по нативному эякуляту, в то время как для инсеминации ооцитов в культуре используется выделенная из него фракция прогрессивно подвижных клеток. В данной работе нами был проведен сравнительный анализ соотношения различных морфологических типов сперматозоидов в этих двух клеточных популяциях. При использовании комбинированного метода выделения фракции подвижных клеток, заключающегося в последовательном применении центрифугирования в перколле и метода всплытия, доля морфологически нормальных сперматозоидов, а также клеток с легкой формой патологии достоверно повышается по сравнению с нативным эякулятом (p меньше 0,0001). Частота встречаемости морфологически нормальных сперматозоидов увеличивается в среднем в 2,3 раза, пограничных – в 1,6 раза, а суммарная доля нормальных и пограничных форм — в 2 раза. Это свидетельствует о высокой эффективности удаления из популяции клеток с аномальной морфологией при выделении подвижной фракции комбинированным способом. Изменение доли нормальных форм в процессе выделения подвижной фракции было проанализировано нами в группах пациентов, имевших исходно от нуля до 14% либо более 15% нормальных сперматозоидов в эякуляте (по критериям нормы, предложенным Крюгером). Повышение доли нормальных клеток было отмечено нами в обеих группах пациентов (p меньше 0,001), что согласуется с результатами, приведенными в работе Холла и соавторов [19]. Однако, и после выделения фракции подвижных клеток достоверные различия между группами пациентов по частоте встречаемости сперматозоидов с нормальной морфологией сохранялись. Нами показано, что частота встречаемости морфологически нормальных сперматозоидов в подвижной фракции не зависит от общей концентрации, доли и концентрации прогрессивно подвижных форм в нативном эякуляте. В то же время величина данного показателя линейно возрастает по мере увеличения доли нормальных сперматозоидов в эякуляте. Полученные данные позволяют сделать два основных заключения. Во-первых, индивидуальные различия по частоте встречаемости нормальных сперматозоидов в нативном эякуляте сохраняются и в прогрессивно подвижной фракции, вне зависимости от таких показателей сперматогенеза как концентрация и подвижность сперматозоидов. Это делает вполне оправданным для прогноза вероятности оплодотворения в культуре оценку доли нормальных сперматозоидов по нативному образцу спермы. Так, в работе Маклера [20] показано, что оценка морфологии сперматозоидов по эякуляту в большей степени коррелирует с результатами оплодотворения ооцитов, чем анализ подвижной фракции. Во-вторых, повышение доли нормальных форм в подвижной фракции происходит как при нормо-, так и при патоспермии. Этот вывод согласуется с результатами, полученными ранее при фракционировании сперматозоидов в градиенте плотности перколла [21, 16]. В нашей работе также было исследовано изменение частоты встречаемости различных типов аномальных сперматозоидов при выделении подвижной фракции. Ранее было показано, что при фракционировании эякулята в градиенте плотности перколла происходит уменьшение доли сперматозоидов с изменениями формы и размера ядра [16], акросомы [16], с аномалиями головки [19, 22], а также с патологией шейки [19]. При этом доля клеток с цитоплазматической каплей [19] или деформациями срединного отдела [16] сохраняется на прежнем уровне. Данные об изменении доли клеток с аномалиями хвоста достаточно противоречивы. В некоторых работах показана неэффективность элиминации сперматозоидов с данной патологией, в то время как в исследовании Лимм и соавторов [23] отмечено, что именно доля клеток с аномалиями хвоста снижается максимально по сравнению с другими аномалиями. Однако, отмеченные разными авторами изменения частот встречаемости различных типов аномалий при выделении фракции подвижных клеток, трудно сопоставимы. Это связано с отсутствием единых критериев нормы, а также универсальной схемы классификации патологий, что особенно существенно при одновременном наличии у сперматозоида нескольких аномалий. Традиционно при анализе морфологии первоочередное внимание уделяется патологиям головки, затем шейки и срединного отдела, и в последнюю очередь — хвоста [24]. Однако, такой подход не имеет достаточно убедительного экспериментального обоснования. В практике работы нашей лаборатории при стандартном анализе морфологии мы использовали другую классификацию аномалий, исходя из биологической значимости различных типов патологий. Так как сперматозоиды с аномалиями хвоста неподвижны или же имеют нарушенное движение, что может сказываться на их оплодотворяющей способности, оценке этой патологии придавали первоочередное значение. На это указывают и данные о том, что доля сперматозоидов с аномалиями хвоста как в нативном эякуляте, так и в подвижной фракции, отрицательно коррелирует с частотой оплодотворения в культуре [23]. Аномалии акросомы являются вторым по значению признаком в нашей классификации. Это связано с тем, что мужчины с глобулоспермией бесплодны, кроме того, установлено наличие отрицательной корреляции между частотой оплодотворения в культуре и долей клеток с патологией акросомы [25]. Следующим по значимости признаком является изменение формы ядра, так как показано, что повышение в эякуляте доли клеток с патологией постакросомного отдела может быть связано с ухудшением морфологии эмбрионов и вследствие этого со снижением частоты наступления беременности [26]. Сперматозоиды с цитоплазматической каплей находятся на следующей ступени иерархии в связи с тем, что появление таких клеток может свидетельствовать о нарушении созревания сперматозоидов. В последнюю очередь фиксируются аномалии шейки и срединного отдела, а также изменения размеров и удвоения головки. Изменение частоты встречаемости различных типов морфологических аномалий при выделении фракции подвижных форм было проанализировано нами с использованием двух различных методических подходов к оценке морфологии. При этом каждый сперматозоид относили только к одному морфологическому типу в соответствии с приведенной выше классификацией (рис. 1) – первый метод, или же учитывали все имеющиеся у сперматозоида аномалии, относя клетки с сочетанной патологией к нескольким морфологическим типам одновременно – второй метод. При использовании второго методического подхода было показано достоверное снижение (p меньше 0,0001) частот встречаемости всех типов аномалий в прогрессивно подвижной фракции по сравнению с нативным эякулятом. В то же время применение первого метода оценки морфологии не выявило при этом изменения доли клеток с уменьшенными размерами акросомы, а также патологией шейки и срединного отдела. Проанализируем возможные причины этого противоречия. При использовании стандартного подхода у сперматозоидов с сочетанной патологией фиксировалась только одна аномалия, доминирующая с точки зрения иерархической системы классификации. Так как патология шейки занимает низшую ступень в используемой нами иерархии морфологических аномалий, то при стандартном анализе отнесение клетки к данному типу означает отсутствие у нее каких-либо других патологий. В то же время аномалия шейки часто сочетается с другими формами патологий, так как частота ее встречаемости, выявленная при анализе, учитывающем множественные аномалии, заметно выше, чем при использовании стандартного подхода (17,2±0,9% и 3,8±0,3% соответственно). В связи с тем, что частота встречаемости аномалий шейки во фракции подвижных форм достоверно снижается по сравнению с нативным эякулятом (табл. 2), а доля клеток, имеющих только данную патологию, сохраняется на прежнем уровне (табл. 3), можно сделать вывод о том, что наблюдаемое изменение происходит в основном за счет элиминации сперматозоидов, имеющих сочетанную патологию. Аналогично можно объяснить снижение частоты встречаемости аномалий, характеризующихся уменьшением размера акросомы, при неизменной доле клеток, имеющих данную патологию в качестве основной либо единственной. Сопоставляя выявленные с использованием разных методических подходов изменения частот встречаемости аномалий шейки и доли клеток с уменьшенными размерами акросомы, можно сделать вывод о том, что при выделении подвижной фракции, элиминация сперматозоидов, имеющих только одну из данных аномалий, неэффективна. Изменение в прогрессивно подвижной фракции по сравнению с нативным эякулятом частоты встречаемости клеток с множественными патологиями было проанализировано нами не только на основании косвенных данных (см. выше), но и непосредственно, путем подсчета доли сперматозоидов с сочетанной патологией. При стандартном подходе к оценке морфологии доля клеток с множественными аномалиями не фиксируется. В то же время установлено, что среднее число аномалий в расчете на один сперматозоид (индекс деформации или индекс тератоспермии) обладает в программе ЭКО большим прогностическим значением, чем доля нормальных форм в эякуляте. Нами показано, что при выделении из эякулята фракции подвижных клеток, частота встречаемости сперматозоидов с множественными аномалиями достоверно снижается (в среднем в три раза). При этом не было отмечено изменения доли аномальных сперматозоидов, не имеющих сочетанной патологии. Это позволяет сделать вывод о том, что при выделении из нативного эякулята фракции подвижных форм наблюдаемое снижение доли аномальных сперматозоидов происходит в основном за счет элиминации клеток, имеющих множественные морфологические патологии. Таким образом, применение комбинированной методики выделения прогрессивно подвижной фракции позволяет получить популяцию сперматозоидов со значительно лучшими морфологическими характеристиками по сравнению с нативным эякулятом как при нормо-, так и при патоспермии. Выводы 1. При выделении из эякулята фракции прогрессивно подвижных клеток доля морфологически нормальных сперматозоидов, а также клеток с легкой формой патологии достоверно повышается в среднем в 2,3 и в 1,6 раза соответственно. Эта закономерность наблюдается как при нормо-, так и при патоспермии. 2. Индивидуальные различия по частоте встречаемости нормальных сперматозоидов в нативном эякуляте сохраняются и в прогрессивно подвижной фракции, вне зависимости от таких показателей сперматогенеза как концентрация и подвижность клеток. 3. Снижение доли аномальных сперматозоидов при выделении из нативного эякулята подвижной фракции происходит в основном за счет элиминации клеток, имеющих множественную морфологическую патологию. 4. При выделении подвижной фракции, элиминация сперматозоидов, имеющих только аномалии шейки или акросомальную область уменьшенного размера, неэффективна. 5. Анализ морфологии сперматозоидов с учетом всего комплекса патологий, характерных для каждой отдельной клетки, более адекватно по сравнению со стандартным методом описывает клеточную популяцию и динамику ее изменения при выделении подвижной фракции. О.А. Леонтьева, О.А. Воробьева НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН Литература 1. Marsh S., Bolton V., Braude P. The effect of morphology on the ability of human spermatozoa to penetrate zona-free hamster oocytes. Aum Reprod 1987; 2: 499–503. 2. Katz D., Diel L., Overstreet J. Differences in the movement of morphologically normal and abnormal human seminal spermatozoa. Biol Reprod 1982; 26: 556–570. 3. Katz D., Morales P., Samuels S., Overstreet J. Mechanisms of filtration of morphologically abnormal human sperm by cervical mucus. Fertil Steril 1990; 54: 513–516. 4. Rogers B., Bentwood B., Campen H., Helmbrecht G., Soderdahl D. Sperm morphology assesment as an indicator of human fertilizing capacity. J Androl 1983; 4: 119–125. 5. Angelopoulos T., Moshel Y.A., Lu L., Macanas E., Grifo J.A., Krey L.C. Simultaneous assessment of sperm chromatin condensation and morphology before and after separation procedures: effect on the clinical outcome after in vitro fertilization. Fertil Steril 1998; 69:740–747. 6. Lee J.D., Kamiguchi Y., Yanagimachi R. Analysis of chromosome constitution of human spermatozoa with normal and aberrant head morphologies after injection into mouse oocytes. Hum Reprod 1996; 9: 1942–1996. 7. Воробьева О.А., Скрипкина О.А., Корсак В.С. Анализ морфологии сперматозоидов в программе ЭКО. Пробл репрод 1995; 3: 71–76. 8. Bostoffe E., Serup J., Rebbe H. Relation between morphologycally abnormal spermatozoa and pregnancies obtained during a twenty-year follow-up period. Int J Androl 1982; 5: 379–386. 9. Grow D.R., Oehninger S., Seltman H.J.,Toner J.P., Swanson R., Kruger T. Sperm morphology as diagnosed by strict criteria: probing the impact of teratozoospermia on fertilization rate and pregnancy outcome in a large in vitro fertilization population. Fertil Steril 1994; 62: 559–567. 10. Kruger T.F., Menkveld R., Stander F., Lombard C.J. et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil Steril 1986; 46: 1118–1123. 11. Kruger T.F., Acosta A.A., Simmons K.F., Swanson R.J. et al. Predictive value of abnormal sperm morphology in vitro fertilization. Fertil Steril 1988; 49: 112–117. 12. Francavilla F., Romano R., Santucci R., Poccia G. Effect of sperm morphology and motile sperm count on outcome of intrauterine insemination in oligospermia and/or asthenozoospermia. Fertil Steril 1990; 53: 892–897. 13. Florence L.H.Ng, De Yi Liu, Gordon Baker H.W. Comparison of Percoll and swim-up methods for sperm preparation from abnormal semen samples. Hum Reprod 1992; 2: 261–266. 14. Shalika S., Dugan K., Pelesh D., Padilla S. A Mono-Percoll separation technique improves sperm recovery of normal and male factor specimens when compared with the swim-up technique. Hum Reprod 1995; 10: 3195–7. 15. Chen S.U., Ho H.N., Chen H.F., Chao K.H., Lin H.R., Huang S.C., Lee T.Y., Yang Y.S. Comparison between a two-layer discontinuous Percoll gradient and swim-up for sperm preparation on normal and abnormal semen samples. Assist Reprod Genet 1995; 12(10): 698–703. 16. Van Der Zvalmen P., Bertin Segal G., Geerts L., Debauche C., Schoysman R. Sperm morphology and IVF pregnancy rate: comparison between Percoll gradient centrifugation and swim-up procedures. Hum Reprod 1991; 4: 581–588. 17. Воробьева О.А., Семенова Е.В., Филатов М.В., Скрипкина О.А. Оценка методом проточной цитофотометрии эффективности очистки сперматозоидов в программе ЭКО. Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины. Материалы XXIV научной сессии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН 1995; 53–54. 18. Cohen J. A Practical Guide to Microsurgical Fertilizationin the Human. at Cohen J., Malter H.E., Talansky B.E., Grifo J. Micromanipulation of Human Gametes and Embryos. Raven Press, New York. 19. Hall J.A., Fishel S.B., Timson J.A., Dowell K., Klentzeris L.D. Human sperm morphology evaluation pre- and post-Percoll gradient centrifugation. Hum Reprod 1995; 36: 342–6. 20. Makler A. Modern methods in semen analysis evaluation, In: Behrman S., Kistener R., Patton G. ed. Pregress in infertility. Boston: Little Brown C. 1988; 633–661. 21. Singer R., Fish B., Levinsky H., Zukerman Z., Sagiv M., Cohen A., Barnet M., Lurie B.B., Lahav M. Separation of human semen on Percoll gradients: effect on percentage of motile and morphologically normal sperm and proportion of acrosome reacted sperm. Int J Fertil Menopausal Stud 1995; 37(3): 161–6. 22. Hughes C.M., Lewis S.E., McKelvey-Martin V.J., Thompson W. Percentage of normal sperm heads is significantly increased by Percoll separation of semen. Int J Androl 1998; 13: 116–9. 23. Lim C.C., Lewis S.E., Kennedy M., Donnelly E.T., Thompson W. Human sperm morphology and in vitro fertilization: sperm tail defects are prognostic for fertilization failure. Andrologia 1998; 69(4): 43–47. 24. World Health Organisation. WHO laboratory manual for examination of human semen and semen-cervical mucus interacnion. third ed. Cambrige: University, 1992: 13–18. 25. Menkveld R., Rhemrev J.P.T., Franken D.R., Vermeiden J.P.V., Kruger T.F. Acrosomal morphology as a novel criterion for male fertility diagnosis: relation with acrosin activity, morphology (strict criteria), and fertilization in vitro. Fertil Steril 1996; 3: 637–644. 26. Parinaud J., Mieusset R., Viefez J., Labal B. et al. Influence of sperm parame- ters on embryo quality. Fertil Steril 1993; 5: 888–892. |
