Влияние плацентарных белков и АФП на подвижность и метаболизм сперматозоидов.
|
Зачатие, как часть генеративной функции человеческого организма, сложный многозвеньевой процесс, в котором мужское и женское начало играют одинаково важную роль. За последние десятилетия отмечено значительное снижение фертильной функции мужчины [7]. Объективно это выражается в возрастании числа бесплодных браков и в ухудшении параметров спермограммы [7, 8]. В связи с этим активно ведутся поиски новых способов лечения этих нарушений, которые в основном направлены на совершенствование методов искусственной доставки сперматозоидов к яйцеклетке [8], однако при этом эффективность лечения остается на довольно низком уровне – 30% зачатий [9].
Важной проблемой является и поиск новых способов оценки фертильности мужчины. Одним из таких «новых» показателей фертильности эякулята стали специфические белки, сопряженные с генеративной системой: ПАМГ-1 (РР-12), ПАМГ-2 (АМГФ, РР-14) [5]. Впервые данные субстраты были выявлены в водных экстрактах плаценты [5] и при дальнейшем изучении обнаружены в больших концентрациях в сперме [5]. Выявлены специфические изменения концентрации этих белков при различных нарушениях фертильной функции как у мужчин, так и у женщин, а также при патологическом течении беременности [5]. Большой интерес в последнее время проявляется к a-фетопротеину (АФП), который при определенных патологических состояниях, сопряженных с генеративной системой, определяется в сыворотке крови у взрослых людей [1]. Цель исследования: определение возможности использования препаратов ПАМГ-1, ПАМГ-2 и АФП для улучшения фертильных свойств спермы. Материал и методы Для обследования привлекались мужчины в возрасте от 21 года до 40 лет. Все мужчины были объединены в клинические группы по признаку сохранности сперматогенеза. В первую группу (контрольную) вошли мужчины с нормальными показателями сперматогенеза (n=77), вторая группа объединила в себе мужчин с олигозооспермией (n=43), третью группу составили мужчины с признаками воспаления в эякуляте (n=50), причем в половине эякулятов отмечена олигозооспермия, четвертую – мужчины с тератозооспермией (n=30). Все группы мужчин были сопоставимы между собой по структуре экстрагенитальной патологии, возрасту и социальным факторам. Фертильные свойства спермы оценивали по общей концентрации сперматозоидов, проценту их подвижности [4] и концентрации ПАМГ-2. Уровень ПАМГ-2 определяли методом иммунодиффузии по О.Ouchterlony в модификации Н.И. Храмковой и Г.И. Абелева [5] со стандартной тест-системой (получена в лаборатории проф. Ю.С. Татаринова). Динамику изменения подвижности гамет исследовали на анализаторе клеточных тест-объектов с лазерным излучением [2]. Экспозиция капилляра над лучом составляла 30 секунд, при температуре термостата 37°С. Показатели подвижности данной пробы получали методом расчета среднего показателя из 10 повторных проходов капилляра с эякулятом над лучом. Подвижность определяли в нативной сперме и после внесения растворов в концентрациях, близких к физиологическим: ПАМГ-1 в количестве 5 мкг/мл, ПАМГ-2 – 50 мкг/мл, АФП – 1000 нг/мл белка. К нативной сперме, служившей контролем, добавляли стерильный физиологический раствор для поправки на разведение растворами белков. Смеси инкубировали при температуре 37°С в течение 10 минут. Определяли концентрацию ионов кальция в эякулятах мурексидным титрометрическим методом и уровень неорганического фосфата колориметрическим методом [3] до и после внесения белковых растворов. Результаты Внесение раствора ПАМГ-1 в эякуляты мужчин первой группы приводило в 83,3% наблюдений к достоверному увеличению подвижности гамет (р меньше 0,05), в остальных 16,7% средние значения подвижности, индуцированной белком, были несколько выше исходных, но это увеличение носило недостоверный характер (р меньше 0,5). В среднем в этой группе подвижность повысилась в 1,4 раза (р меньше 0,001) относительно исходной (табл. 1). Таблица 1. Средние показатели кратности усиления подвижности сперматозоидов при внесении в пробы ПАМГ-1, ПАМГ-2, АФП
Примечание. Кратность усиления подвижности получена простым делением среднего показателя исходной подвижности сперматозоидов на средние показатели индуцированной внесением раствора белка. * – достоверность различий с исходной подвижностью. * – р меньше 0,05; ** – р меньше 0,02; *** – р меньше 0,01; **** – р меньше 0,001. При добавлении ПАМГ-1 в эякуляты мужчин II–IV групп активирования подвижности сперматозоидов в среднем не наблюдалось (табл. 1). В эякулятах с олигозооспермией в индивидуальных пробах у 41,7% выявлено достоверное снижение подвижности гамет (р меньше 0,05), в 50% снижение подвижности носило недостоверный характер (р меньше 0,5), в остальных случаях подвижность вовсе не менялась. В эякулятах с воспалительными изменениями (III группа) внесение раствора ПАМГ-1 в среднем не изменяло подвижности сперматозоидов (табл. 1). Однако в индивидуальных пробах, если исходная подвижность была в пределах нормы (50% наблюдений), внесение ПАМГ-1 приводило к достоверному усилению подвижности гамет в среднем в 1,4±0,1 раза (р меньше 0,05). В тех же случаях, когда воспалительные изменения сочетались с олигозооспермией, ПАМГ-1 либо достоверно угнетал подвижность гамет в среднем в 0,6±0,1 раза (40%, р меньше 0,05), либо не влиял на нее. В IV группе внесение ПАМГ-1 в среднем не приводило к активированию подвижности (табл. 1). В 33,3% индивидуальных проб наблюдалось значительное снижение подвижности сперматозоидов в среднем в 0,6±0,1 раза (р меньше 0,05). В половине случаев ПАМГ-1 не влиял на подвижность сперматозоидов (р меньше 0,5), и лишь в 1 эякуляте, с субфертильными показателями, произошло усиление подвижности гамет в 1,85 раза (р меньше 0,01). Нами не отмечено какой-либо связи с изменением подвижности сперматозоидов при внесении раствора ПАМГ-1 и эндогенным уровнем ПАМГ-2 спермы. Внесение раствора ПАМГ-1 в эякуляты не вызывает изменений в кальциевом и фосфорном обмене. Раствор АФП при добавлении в эякуляты мужчин I клинической группы приводит к значительному усилению в среднем в 1,75±0,1 раза (р меньше 0,05) подвижности гамет в 88,9% случаев, т.е. в тех случаях, где уровень эндогенного ПАМГ-2 колебался от 1:4 до 1:32–1:64. Если уровень ПАМГ-2 спермы был экстремально низким (1:2 и ниже), подвижность не претерпевала существенных изменений (р меньше 0,5). Внесение раствора АФП в эякуляты II клинической группы в среднем не оказывало влияния на подвижность гамет. В индивидуальных пробах активирование подвижности происходило в 16,67% в среднем в 1,3±0,05 раза (р меньше 0,05), в эякулятах с олигозооспермией I степени и титром ПАМГ-2 спермы от 1:4 – 16 до 1:32. В одинаковом проценте случаев, 41,67%, подвижность не изменялась, либо значительно угнеталась в среднем в 0,5±0,2 раза (р меньше 0,05). Добавление раствора АФП в эякуляты III клинической группы в среднем не изменяло подвижность сперматозоидов (табл. 1). Однако в индивидуальных пробах отмечено значительное усиление подвижности мужских гамет в среднем в 1,4±0,1 раза (р меньше 0,02) в тех эякулятах, показатели подвижности которых находились в пределах нормы, и титр ПАМГ-2 спермы колебался от 1:4 – 16 до 1:32. В остальных 50% случаев подвижность угнеталась с различной степенью выраженности. В IV группе эякулятов внесение раствора АФП в среднем не меняло подвижности сперматозоидов (табл. 1). В индивидуальных пробах при нормальной исходной подвижности, что наблюдалось в 33,3% случаев, АФП достоверно усиливал подвижность сперматозоидов в среднем в 1,4±0,2 раза (р меньше 0,05). При сочетании тератозооспермии с олигозооспермией подвижность не менялась в 33,3%, либо происходило ее угнетение – 33,3% в среднем в 0,45±0,3 раза (р меньше 0,05). Кроме влияния на подвижность сперматозоидов, АФП изменяет уровень неорганического фосфата в сперме. В среднем уровень неорганического фосфата в эякулятах I клинической группы составил 4,5±0,1 мг%. В эякулятах с патологическими изменениями (II–IV группы) этот показатель составил 7,6±0,25 мг% (р меньше 0,02 к первой группе). При инкубировании спермы I группы при температуре 37°С через 10 мин уровень неорганического фосфата снизился в среднем до 3,9±0,1 мг% (р меньше 0,05). При добавлении же в эякуляты I группы раствора АФП снижение концентрации неорганического фосфата происходило значительно больше, и в среднем его концентрация составила 2,3±0,2 мг% (р меньше 0,001). Инкубация всех эякулятов II группы и эякулятов III и IV группы, в которых отмечалась олигозооспермия, без АФП незначительно изменяла концентрацию неорганического фосфата: его средние показатели составили 7,3±0,3 мг% (р меньше 0,5). При внесении АФП показатели концентрации неорганического фосфата в среднем практически не изменялись – 7,2±0,3 мг% (р больше 0,5). В тех индивидуальных пробах, где патологические изменения эякулята не сопровождались сниженными показателями исходной подвижности, и внесение АФП приводило к значительному повышению подвижности, снижение уровня неорганического фосфата происходило более значительно. Так, в среднем в эякулятах с нормальными показателями исходной подвижности концентрация неорганического фосфата снизилась: в III группе (50% наблюдений) с 6,2±0,4 мг% до 3,7±0,4 мг% (р меньше 0,02), в IV группе (33,3% наблюдений) с 4,9±0,2 мг% до 3,4±0,1 мг% (р меньше 0,05). В тех случаях, где подвижность не менялась, не менялся и уровень фосфата. При угнетении подвижности АФП уровень неорганического фосфата несколько повышался в среднем до 9,8±0,6 мг% (р меньше 0,1). Несколько иное влияние на подвижность сперматозоидов в эякулятах оказывало внесение раствора ПАМГ-2 (табл. 1). Так, в эякулятах I группы происходило значительное снижение подвижности сперматозоидов в 46% наблюдений (р меньше 0,05), титр эндогенного ПАМГ-2 в этих эякулятах составил от 1:2 до 1:64. Усиление подвижности наблюдалось в 4% проб (р меньше 0,05) с титром ПАМГ-2 1:16 во всех случаях. У половины проб подвижность не претерпевала существенных изменений (р меньше 0,5). Титр ПАМГ-2 этих проб колебался в пределах 1:4 – 1:32—64. Внесение раствора ПАМГ-2 в эякуляты II клинической группы в среднем приводило к достоверному усилению подвижности гамет (табл. 1). Во всех индивидуальных пробах эякулятов подвижность, индуцированная ПАМГ-2, была выше исходной, и в 75% была значительна и достоверно отличалась от начальной в среднем в 2,9±0,5 раза (р меньше 0,02). В III клинической группе внесение раствора ПАМГ-2 усиливало подвижность только в эякулятах с уровнем лейкоцитов от 1·107 до 2·107, причем в 89,5% это усиление носило значительный характер и в среднем составило 2,4±0,8 раза (р меньше 0,05), в остальных 10,5% повышение подвижности имело незначительные изменения (р меньше 0,5). В тех эякулятах, где уровень лейкоцитов превышал 2·107 в 1 мл, внесение ПАМГ-2 в 44,4% значительно снижало подвижность сперматозоидов по сравнению с исходной в среднем в 0,7±0,1 раза (р меньше 0,05). В 55,5% наблюдений существенных сдвигов в показателях подвижности гамет нами не отмечено. Достоверное усиление подвижности произошло лишь в 1 эякуляте с уровнем ПАМГ-2 сперме 1:16 (р меньше 0,02). Внесение раствора ПАМГ-2 в эякуляты IV клинической группы в среднем снижало показатели подвижности (табл. 1). Причем во всех индивидуальных пробах подвижность с ПАМГ-2 была ниже исходной. При исследовании влияния ПАМГ-2 на изменения в биохимическом составе спермы нами выявлено его воздействие на метаболизм ионов Са2+ в плазме семенной жидкости. Средний уровень эякулятов ионов Са2+ в исследуемых эякулятах составил 36,5±0,2 мг%, независимо от показателей подвижности, уровня лейкоцитов и морфологии гамет (табл. 2). При достоверном усилении подвижности сперматозоидов раствором ПАМГ-2 происходило достоверное снижение уровня кальция в сперме относительно исходных показателей, тогда как без внесения ПАМГ-2 изменения концентрации ионов Са2+ были незначительны. Это явление наблюдалось в эякулятах II группы (табл. 2) и в эякулятах III группы с нормальной подвижностью в среднем до 13,5±4,5 мг% (р меньше 0,02). Таблица 2. Концентрации ионизированного кальция и неорганического фосфата в эякулятах до и после внесения растворов ПАМГ-2 и АФП
Примечание. * – достоверность различий между исходной концентрацией ионов кальция и индуцированной внесением раствора ПАМГ-2. * – р меньше 0,05; ** – р меньше 0,02; *** – р меньше 0,01; **** – р меньше 0,001. При внесении ПАМГ-2 в эякуляты I группы в среднем интенсивность потребления кальция несколько снижалась, и его показатели были несколько выше, чем в пробах, инкубировавшихся без белка (табл. 2). То же явление отмечалось в части эякулятов III группы с уровнем лейкоцитов более 2·107, где средний уровень ионизированного кальция составил 34,5±0,6 мг% (р меньше 0,5). Внесение раствора ПАМГ-2 в эякуляты IV группы в среднем незначительно снижало концентрацию ионизированного кальция (табл. 2). Однако в тех пробах эякулятов, где исходная подвижность значительно угнеталась после внесения ПАМГ-2, концентрация ионов кальция могла быть даже несколько выше исходной в среднем на 29,5±2%. Обсуждение и выводы АФП и ПАМГ-1 оказывают активирующее воздействие на сперматозоиды, улучшая их подвижность в эякулятах с нормальными показателями подвижности. В эякулятах с патологическими изменениями в спермограмме препараты этих белков либо не изменяют подвижность гамет, либо иммобилизируют их. Это подтверждается изменением обмена неорганического фосфата при внесении АФП, концентрация которого значительно снижается при увеличении подвижности гамет. По-видимому, механизм действия АФП состоит в активировании метаболизма по пути образования макроэргов, на синтез которых в основном и потребляется неорганический фосфат [10]. При наличии полной компенсации, что наблюдается в нормальных эякулятах и в эякулятах с признаками воспаления и тератозооспермией, но нормальной подвижностью гамет, внесение АФП приводит к усилению подвижности через повышение количества поступающей энергии. Если же в системе эякулята имеет место некоторая дизадаптация, выражающаяся в снижении подвижности, то простое увеличение доступной энергии не поддерживается другими системами регуляции метаболизма клетки, происходит срыв компенсации и подвижность угнетается. Действие ПАМГ-1 пока мало понятно и требует дальнейшего изучения. В отличие от них ПАМГ-2 оказывает регуляторное воздействие на подвижность сперматозоидов, активируя их в эякулятах со сниженной исходной подвижностью и признаками хронического воспаления генитального тракта. В нормальных эякулятах, в эякулятах с признаками обострения воспалительного процесса и тератозооспермией подвижность, при внесении ПАМГ-2, либо не меняется, либо угнетается. Это воздействие на половые клетки опосредуется, по нашему мнению, влиянием на кальциевый обмен эякулята. Давно установлено, что ионы кальция являются одним из основных регуляторов клеточного метаболизма и их регулирующее действие сопряжено с цитолеммой [6]. По-видимому, ПАМГ-2 является ассоциированным с клеточной мембраной метаболитом, регулирующим проницаемость ионных каналов. Соединяясь с мембраной сперматозоида, ПАМГ-2 усиливает ток ионов кальция внутрь клетки, что должно приводить к усилению внутриклеточного метаболизма [6]. Такое патологическое состояние, как воспаление, не может не затронуть состояние цитолеммы и вызывает различные патологические изменения в ней, кроме того, олигозооспермия и тератозооспермия также сопровождаются изменениями клеточной мембраны [4]. Данные изменения, по-видимому, и приводят в определенных случаях к изменению подвижности гамет, и эндогенный ПАМГ-2 не в состоянии полностью скомпенсировать данные нарушения. Если система эякулята находится в состоянии умеренной дизадаптации к возникшим нарушениям (хроническое воспаление в стадии ремиссии, идиопатическая олигозооспермия), то внесение ПАМГ-2, усиливая потребление кальция, приводит к усилению подвижности сперматозоидов через усиление внутриклеточного метаболизма. Если же адаптационные механизмы нарушены более существенно и имеет место декомпенсация (острое воспаление, тератозооспермия), то повышенное поступление кальция внутрь клетки приводит к дальнейшему срыву компенсации и клинически это проявляется угнетением подвижности. Внесение ПАМГ-2 в нормальные эякуляты приводит к снижению подвижности и повышению концентрации кальция в сперме. Повышая проницаемость клеточной мембраны для ионов кальция, ПАМГ-2 вносит разбалансировку в систему нормального эякулята. Резкое повышение концентрации кальция с одной из поверхностей мембраны приводит к прекращению ее функционирования [6], что, по-видимому, имеет место в данном случае. Клинически это приводит к снижению подвижности. С учетом этих данных по воздействию ПАМГ-2 на функциональные свойства сперматозоидов открываются новые возможности к использованию растворов этого белка для улучшения основного показателя фертильности эякулята – подвижности сперматозоидов в нем. Причем можно не опасаться, что внесение ПАМГ-2 приведет к возникновению патологической беременности, т.к. активирование происходит дифференцированно: в эякулятах с тератозооспермией и острым воспалением, т.е. там, где беременность не желательна, подвижность еще больше угнетается и риск возникновения патологической беременности снижается во много раз. Это свойство ПАМГ-2 может быть использовано как прогностический тест для оценки перспектив возникновения беременности от данного мужчины с последующим более углубленным его обследованием и лечением. Л.В. Посисеева, А.М. Герасимов Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова МЗ РФ, Ивановская государственная медицинская академия, кафедра акушерства и гинекологии Литература 1. Симпсон Дж. Л., Голбус М.С., Мартин Э.О., Сарто Г.Е. Генетика в акушерстве и гинекологии. Перев. с англ. М.: Медицина 1985; 352. 2. Еськов А.П., Лужецкий А.С., Гурилев О.М. и др. Оценка подвижности сперматозоидов человека с помощью лазерного устройства. Урол нефрол 1986; 4: 57–59. 3. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь 1976; 312. 4. Руководство по андрологии. Под ред. О.Л. Тиктинского. Л.: Медицина 1990; 416. 5. Татаринов Ю.С., Посисеева Л.В., Петрунин Д.Д. Специфический альфа2-микроглобулин (гликоделин) репродуктивной системы человека: 20 лет от фундаментальных исследований до внедрения в клиническую практику. Иваново, МИК, 1998; 128. 6. Эндокринология и метаболизм: пер. с англ. Под. ред. Ф.Фелига, Дж.Д. Бакстера, А.Е. Бродуса, Л.А. Фромена. М.: Медицина 1985. В 2 т.: T.I. 520 с. Т. II. 416 с. 7. Sharpe Richard М., Skakkebaek Niels E. Are oestrogens involved in falling sperm counts and disorders of the male reproductive tract? Lancet 1993; 8857: 1392–1395. 8. Jequier А.М. Male infertility. Brit J Obstet Gynaecol 1993; 100: 7: 612–614. 9. Panel P., Chansigaud J.P., de Meeus J.B., Kamina P., Magnin G. Inseminations artificielles intra-utйrines: indication, technique, rйsults; б propos de 83 observation. J Gynecol Obstet Biol Reprod 1995; 24: 496–504. 10. Slater E.C. How does F1 make ATR? In.: Membrane bioenergetics. Ed. C.Lec, G.Schatr, L.Ernster. Addiso-Wesley Publishing Company, 1979. |