a2-Микроглобулин фертильности (АМГФ) как ранний критерий имплантации после ЭКО.
|
Оптимальные условия для успешной имплантации и беременности в условиях ЭКО у человека остаются недостаточно изученными.
Многие исследования посвящены определению условий овариальной стимуляции в фолликулярную фазу с целью получения гамет хорошего качества, которое в дальнейшем способствует получению in vitro жизнеспособных эмбрионов. В то же время, данные об условиях, необходимых для оптимальной рецепции эндометрия во время имплантации эмбриона в условиях ЭКО, немногочисленны. Биохимическое изучение многих протеинов, продуцирующихся в эндометрии и определяемых в периферической циркуляции, показало, что плацентарный протеин 14 (PP14) может явиться одним из перспективных критериев полноценности эндометриальной функции [1]. Впервые белок из децидуальной части плаценты человека был выделен Д.Д. Петруниным и соавт. в 1976 г. и назван a2-микроглобулином фертильности [2]. В последующие годы этот белок был выделен и охарактеризован несколькими группами исследователей. АМГФ и его аналог РР14 антигенно идентичны [3]. РР14, имеющий множество синонимов (ассоциированный с беременностью a2-глобулин – a2-PEG и прогестан-ассоциированный эндометриальный протеин – (РЕР) является основным протеином позднего секреторного и децидуализированного эндометрия [4, 5]. Он является маркером эндометрия [6] и определяется только в тканях репродуктивных органов [7]. Биологическая роль этого протеина в имплантации остается неясной. Найдено, что РР14 в зависимости от дозы ингибирует связывание сперматозоидов с зоной пеллюцидой [8]. Недавно показано, что эпителиальные клетки маточных труб секретируют РР14 в больших количествах в культуральную среду, независимо от фазы менструального цикла [9]. У женщин в крови концентрация РР14, низкая в середине цикла, начинает повышаться через неделю после овуляции, совпадая с имплантационным периодом, достигает максимума к началу следующего менструального цикла. При наступлении беременности концентрация РР14 достигает максимума через 4 нед, затем выходит на плато в течение 8–10 нед, далее снижается параллельно с уменьшением концентрации b-ХГ в сыворотке [10–12]. Концентрация РР14 в амниотической жидкости в 100–1000 раз выше, чем в крови матери. Самый высокий уровень РР14 в амниотической жидкости найден на 8–10-й неделе беременности [13]. Уровень РР14 в циркулирующей крови увеличивается в 20 раз от поздней секреторной фазы до конца I триместра беременности. Авторы проводят параллель между этим фактом и увеличением в это время массы decidua [14]. Относительно биологических свойств этого вещества известно лишь то, что он обладает иммуносупрессорной активностью. Установлено, что экстракты эндометрия I триместра беременности ингибируют лимфоцитарную реакцию и митогениндуцированную лимфоцитарную пролиферацию [15]. Относительно механизмов, контролирующих уровень РР14, известно:
Ряд авторов утверждают, что прогестерон оказывает непрямое влияние на секрецию РР14. Во-первых, значительный интервал (до 6 дней) имеется между изменением уровня прогестерона и уровня РР14. Во-вторых, уровень РР14 не снижается после обработки антагонистом прогестерона Ru486 [19]. В-третьих, уровень РР14 быстро снижается после 9–10-й недели беременности, тогда как уровень прогестерона продолжает увеличиваться [14]. Установлено, что уровень эстрадиола в сыворотке на 9-й день цикла коррелирует с последующим уровнем РР14 на 21–23-й день. Этот факт свидетельствует о том, что состояние эндометрия в фолликулярной фазе влияет на последующую секреторную способность лютеиновой фазы [20]. Многие работы, проведенные с целью предсказания имплантационного «окна», показали, что в циклах ЭКО имеются различия в концентрации РР14 во время лютеиновой фазы менструального цикла. При наступлении беременности концентрация РР14 выше [21, 22]. Однако имеются данные, которые противоречат этим фактам [23]. Цель исследования В настоящее время из-за противоречивости и недостаточности сведений относительно уровня АМГФ в сыворотке крови женщин нет стандартных количественных параметров, которые могли бы характеризовать наступление и прогноз беременности. В настоящей работе мы изучали динамику показателей АМГФ и b-ХГ (хорионический гонадотропин) в сыворотке крови женщин, включенных в программу ЭКО, после переноса эмбрионов в полость матки и сравнивали эти показатели в трех группах женщин: с прогрессирующей беременностью; с неразвивающейся беременностью; с ненаступившей беременностью. Показано, что имеется положительная корреляция между уровнем АМГФ в сыворотке крови женщин и имплантацией бластоцисты в эндометрий матки. Материал и методы Концентрацию АМГФ определяли у 210 женщин, проходивших лечение бесплодного брака методом ЭКО. Сыворотку крови для определения АМГФ получали у пациенток, которым было показано проведение гормонального мониторинга уровня стероидных (эстрадиол и прогестерон) и гонадотропных (b-ХГ) гормонов при стимуляции суперовуляции и лютеиновой фазы. Суперовуляция проводилась по схемам с использованием агонистов ГрРГ (депо-декапептил, декапептил-daily, золадекс, супрефакт) и экзогенных мочевых гонадотропинов (пергонал, хумегон, меногон, метродин). Первое определение концентрации АМГФ проводилось в день введения овуляторной дозы ХГ (профази, прегнил, хорагон) – день 0, последующие – на 15, 21-й день после аспирации ооцитов (день пункции – день 2). Кроме этого, определялась концентрация АМГФ на 2-й день менструального цикла у женщин с короткой схемой стимуляции. Оплодотворение, культивирование и перенос эмбрионов осуществлялись по стандартной методике, принятой в отделении ЭКО. Сыворотку крови, оставшуюся после определения гормонов, замораживали и хранили при –20°С для последующего анализа. Содержание АМГФ в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием оригинального диагностического набора АМГФ-ФЕРТИТЕСТ-М, разработанного в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН на основе моноклональных антител к АМГФ [24]. Результаты лечения оценивались эхографически по визуализации или отсутствию плодного яйца в местах имплантации, наличию сердцебиения плода в сроки 4 нед и более после оплодотворения, а также по динамике роста концентрации b-субъединиц ХГ в сыворотке крови. b-субъединицы ХГ определяли прямым иммунохемилюминесцентным методом [25] на автоматической установке Chiron Diagnostics ACS 180 (“Chiron Diagnostics Corp.”, USA). В зависимости от результатов обследованные женщины разделены на 3 клинические группы: группа 0 – небеременные; группа 1 – женщины с неразвивающейся или прервавшейся в сроки до 8 нед беременностью; группа 2 – пациентки с прогрессирующей беременностью сроком 8 нед и более. Полученные данные математически обработаны с использованием пакета компьютерных программ «Statistica-5», с помощью которых вычислялись средние показатели, стандартное отклонение, коэффициенты корреляции, а также критерий t-Стьюдента при уровне значимости меньше 0,05. Результаты исследования Установлено, что в разных группах динамика количества АМГФ была разной. В таблице представлены статистические различия между показателями у беременных (группа 2) и небеременных (группа 0) женщин. В день 0 количество АМГФ в этих группах низкое: соответственно 8,6 нг/мл (n=25) и 3,1 нг/мл (n=68), однако достоверно различается (р меньше 0,05). Далее к 15-му дню после пункции оно увеличивается в обеих группах: соответственно 215 нг/мл (n=28) и 147,3 нг/мл (n=72), причем эти значения АМГФ достоверно различаются (р меньше 0,05). К 21-му дню после пункции происходит дальнейшее нарастание концентрации АМГФ: соответственно 353,7 нг/мл (n=30) и 279,4 нг/мл (n=84), но эти значения достоверно не различаются (p больше 0,05). В то же время показатели b-ХГ в обеих группах женщин на 15-й и 21-й дни после пункции достоверно различаются. Содержание АМГФ, b-ХГ, эстрадиола (E2) и прогестерона (Р) у обследованных женщин (средние показатели ± SD)
* Достоверно различающиеся значения в группе небеременных и женщин с неразвивающейся беременностью. ** Достоверно различающиеся значения в группе женщин с неразвивающейся и прогрессивной беременностью. # Достоверно различающиеся значения в группе небеременных и женщин с прогрессивной беременностью. Количественные показатели АМГФ и b-ХГ различаются в группах небеременных (группа 0) и женщин с замершей беременностью (группа 1). В день 0 количество АМГФ в обеих группах низкое и достоверно не различается. Далее к 15-му и 21-му дням оно увеличивается, однако достоверно не различается. Показатели b–ХГ в обеих группах женщин на 15-й и 21-й дни достоверно различаются. Кроме этих показателей в названных группах женщин достоверно различаются значения количества прогестерона на 2-й день менструального цикла, а также количества АМГФ в день 2 (день пункции). В группе с неразвивающейся беременностью (группа 1) концентрация АМГФ возрастает медленнее, чем в группе с прогрессирующей беременностью (группа 2), однако различия в показателях недостоверны. Концентрация b-ХГ в обеих группах достоверно различается на 15-й день после пункции (p меньше 0,05). На 21-й день после пункции не выявлено достоверных различий между концентрацией b-ХГ в этих группах женщин. Следует отметить отдельно случаи (3 из 22) неразвивающейся беременности, когда при высоких значениях b-ХГ на 21-й день (3905, 2038, 1446 мМЕ/мл) беременность наступила, но не стала прогрессивно развиваться. Значения концентрации АМГФ в этих случаях были ниже (180, 180, 70 нг/мл), чем у женщин с прогрессирующей беременностью (353,8 нг/мл). Можно предположить, что в данном случае имела место ситуация, когда нормально функционировал трофобласт, но нарушения в децидуализированном эндометрии способствовали «замиранию» беременности. Проведенный нами корреляционный анализ показал, что имеется положительная корреляция между концентрацией АМГФ в день 0 и наступлением беременности. Положительная корреляция существует между концентрацией b-ХГ на 15-й и 21-й дни после пункции и наступлением беременности. Обсуждение результатов АМГФ представляет протеиновый продукт человеческого эндометрия, максимальная концентрация которого наблюдается в поздней лютеиновой фазе менструального цикла [4]. Многие авторы считают РР14 (АМГФ) наиболее достоверным биохимическим маркером полноценной функции эндометрия [6]. Эта точка зрения подтверждается представленными результатами, которые свидетельствуют, что концентрация АМГФ в день 0 (день введения ХГ) коррелирует с наступлением беременности и, по-видимому, отражает имплантационный потенциал секреторного эндометрия. Данные нашей работы согласуются с результатами ряда исследователей [8, 24], но противоречат данным других авторов [23], считающих, что концентрация РР14 в лютеиновой фазе не различается в циклах с разным исходом ЭКО. Данные противоречия могут быть связаны либо с различными методиками определения АМГФ (РР14), в частности «чистотой» антител, использующихся для определения этого фактора, либо с индивидуальными особенностями женщин. Поэтому чтобы исключить последнее, необходимо участие в исследовании большой группы женщин. В нашей работе было показано, что на фоне прогестероновой поддержки происходит нарастание уровня АМГФ к 15-му и 21-му дням после TVP. То есть синтез АМГФ, с одной стороны, зависит от прогестерона, с другой стороны, независимо от получаемой прогестероновой поддержки уровень АМГФ в группе беременных женщин выше, чем у небеременных. Эти данные не противоречат результатам работ, в которых не установлена корреляция между продукцией РР14 в средней и поздней лютеиновой фазе и прогестероном [1]. Все это свидетельствует о том, что действие прогестерона и РР14 на эндометрий может быть параллельным, но независимым. Теоретически РР14 (АМГФ) может воздействовать на имплантацию в 2-х случаях: в маточных трубах во время оплодотворения и в эндометрии во время имплантации. РР14 секретируется в больших количествах эпителиальными клетками маточных труб [9]. Современные данные свидетельствуют о локализации РР14 в поверхностном, железистом эпителии и стромальных клетках [26]. Поскольку физиологическая функция АМГФ (РР14) не известна, высокий уровень АМГФ в сыворотке женщин можно лишь спекулятивно рассматривать как шанс беременности. Тем не менее полученное нами достоверное различие между уровнем АМГФ в группах женщин с наступившей и ненаступившей беременностью на 2-й день менструального цикла и в день 0 позволяет высказать предположение о возможности использования АМГФ в качестве одного из прогностических критериев наступления беременности. Относительно роли, которую может играть АМГФ, можно лишь предположить, что этот белок, обладающий иммуносупрессорной активностью, необходим для имплантации бластоцисты и поддержания беременности на ранних сроках. Это предположение укладывается в рамки современных представлений об иммуносупрессии материнской иммунной активности, играющей роль в поддержании нормальной беременности, реализующейся на децидуально-трофобластическом уровне [27]. Таким образом, концентрация АМГФ наряду с концентрацией b-ХГ может служить ранним критерием имплантации бластоцисты и дальнейшего развития беременности у женщин, участвующих в программе ЭКО. Е.А. Калинина, В.А. Лукин, И.И. Калинина, И.Г. Торганова, Д.В. Широкова, Г.Д. Попов, В.И. Коренев, М.И. Маршицкая, М.М. Болтовская, Т.А. Старостина Kлиника планирования семьи Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Институт морфологии человека РАМН, Москва Литература 1. Chard T., Olajide F. Endometrial protein PP14:A new test of endometrial function. Reprod Med Rev 1994; 3: 43–52. 2. Петрунин Д.Д., Грязнова И.M., Петрунина Ю.А., Татаринов Ю.С. Иммунохимическая идентификация органоспецифического глобулина плаценты человека и его содержание в амниотической жидкости. Бюлл экспер биол и мед 1976; 7: 803–804. 3. Татаринов Ю.С., Олифиренко Г.А., Петрунин Д.Д. Успехи соврем биол 1985; 6: 465–472. 4. Wahistrom T., Koskimies A.I.,Tenhunen A. et al. Pregnancy proteins in the endometrium after follicle aspiration for in vitro fertilization. Ann N Y Acad Sci 1985; 442: 402. 5. Julkunen M., Koistinen R., Siukkari A.M. et al. Identification by hybridization histochemistry of human endometrial cells expressing mRNAs encoding a uterine beta-lactoglobulin homologue and insulin-like growth factor-binding protein-1. Mol Endocrinol 1990; 4: 700–707. 6. Seppala M., Koistinen R., Rutanen E.M. Uterine endocrinology and paracrinology:insulin-like grouth factor binding protein and placental protein 14 revisited. Hum Reprod 1994; 917–925. 7. Chard and Olajide. Endometrial protein pp 14. Reprod Med Rev 1994; 3: 43–52. 8. Oehninger S., Coddinton C.C., Hodgen G.D. et al. Factors affecting fertilization. Fertil Steril 1995; 63: 377–383. 9. Sarodigan E., Djahanbakhch O., Kervancioglu M.E. et al. Placental protein 14 production by human Fallopian tube epithelial cells. Hum Reprod 1997; 12: 1500–1507. 10. Joshi S.G., Bank J.F., Henriques E.S. Serum levels of progesterone-associated endometrial protein during the menstrual cycle and pregnancy. J Clin Endocrinol Metab 1982; 55: 642–647. 11. Bell S.C., Hales M.W., Patel S.R. et al. Protein synthesis and secretion by the human endometrium and decidua during early pregnancy. J Obstet Gynaecol 1985; 92: 793. 12. Than G.N., Tatra G., Bohn H. et al. Placental. Protein 14 serun following conception. Med Sci Res 1987; 15: 1243. 13. Julkunen M., Rutanen E.M., Koskimies A. et al. Distribution of PP14 in tissue and body fluids during pregnancy. Br J Obstet Gynaecol 1985; 92: 1145. 14. Bell S.D. Secretory endometrial decidual proteines and their function in early pregnancy. J Reprod Fertil Suppl 1988; 36: 109. 15. Bolton A.E., Pockley A.G., Clough K.J. et al. Identification of placental protein 14 as an immunosupressive factor in human reproduction. Lancet 1987; 1: 593. 16. Fay T.N., Jacobs I.J., Teisner B. et al. A biochemical test for the direct assessment of endometrial function. Hum Reprod 1990; 5: 382. 17. Seppala M., Ronnberg L., Karonen S.L. et al. Micromized oral progesterone increases the circulating level of endometrial secretory PP14/beta-lactoglobulin homologue. Hum Reprod 1987; 2: 453. 18. Than G., Seppala M., Julkunen M. et al. The effect of danasol on the circulating levels of 34 k insulin-like grouth factor-binding protein and endometrial beta-lactoglobulin in cultured decidual and chorionic villus cells. Hum Reprod 1987; 2: 431. 19. Howell R.J.S., Olajide F., Teisner B. et al. Circulating levelds of PP14 and progesterone following RU 38486. Fertil Steril 1989; 52: 66. 20. Seppala M., Martikainen H., Ronneberg L. et al. Supression of prolactin secretion during ovarion heperstimulation is followed by elevated serum levels of endometrial PP14 in the late luteal phase. Hum Reprod 1989; 4: 389. 21. Wood P.L., Iffland C.A., Allen E. et al. Serum levels of pregnancy-associated endometrial globulin, a glycosylated-lactoglobulin homologue in successful assisted conception. Hum Reprod 1990; 5: 421. 22. Check J.H., Nowroozi K., Chase J. et al. Serum progesteron-associated endometrial protein levels in conception versus nonconceptions cycles following in vitro fertilization embryo transfer. In Vitro Fertil Embryo Transfer 1990; 7: 134. 23. Edwards R.G. Human uterine endocrinology and the implantation window. Ann N Y Sci 1988; 541: 445–454. 24. Здановский В.М., Шевченко В.В., Макаров О.В. и др. Прогностическое значение количественного определения микроглобулина фертильности (АМГФ) в сперме и сыворотке крови пациентов, включенных в программу ЭКО. Пробл репрод 1996; 3: 18–22. 25. Kaplan L.A. Human chorionic gonadotropin.In: Kaplan L.A., Pesce A.J. Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation. St Louis CV Mosby 1989; 938–944. 26. Lalitkumar P.G.L., Jayarru Sengupta, Anjali A. Karande, Ghosh D. Placental protein 14 in endometrium during menstrual cycle and effect of early luteal phase mifepristone administration on its expression in implantation stage endometrium in the rhesus monkey. Hum Reprod 1998; 541: 12: 3478–3486. 27. Cухих Г.Т., Ванько Л.В., Кулаков В.И. Иммунитет и генитальный герпес. 1997; 220. |