Использование фолликулярной жидкости человека на этапе культивирования гамет и эмбрионов.
|
В медицине найдется немного примеров столь быстрого развития от теории к практике, как в случае лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения яйцеклетки (ЭКО) и трансплантации эмбриона в матку пациентки. Однако современная наука не стоит на месте, и усилия исследователей направлены на постоянное совершенствование существующих методик ЭКО. Одним из важных этапов этой программы является выделение фракции спермиев с прогрессивным движением и культивирование гамет. Обычные способы выделения (методом «всплывания» [14, 15], по Ватеву [1]) позволяют получить в выделенной фракции 40–80% сперматозоидов, способных к оплодотворению ооцитов в условиях in vitro [8]. Из литературы известно, что биологические жидкости улучшают функциональные свойства спермиев [11, 13], увеличивая скорость движения [16, 19] и пенетрационную способность [9, 18] спермиев. Особый интерес исследователей вызывает фолликулярная жидкость (ФЖ), поскольку она легко может быть получена в достаточном количестве во время процедур вспомогательной репродукции [6] и является единственной натуральной средой, обладающей всеми необходимыми компонентами, гормональными и биохимическими, для активации капацитативных свойств и акросомной реакции сперматозоидов, их проникновения через прозрачную оболочку ооцита.
Целью работы было изучение переживаемости и оплодотворяющей способности спермиев после выделения фракции клеток с быстрым прогрессивным движением в среде Menezo B-2 (контроль), в средах, представляющих собой комбинацию этой среды и нативной ФЖ в разных соотношениях, а также исследование возможности использования ФЖ на этапе культивирования гамет в программе ЭКО. Материал и методы ФЖ получали из доминантного фолликула размером 18–20 мм на 12–14-й день менструального цикла у женщин в возрасте 20–42 лет, проходивших курс лечения по поводу бесплодия методом ЭКО на базе Центра репродукции Харькова. Индукцию овуляции проводили по длинному протоколу с использованием агонистов рилизинг-гормона (Suprefact, «Hоechst») в сочетании с препаратом ФСГ (Metrodin, «Serono»). ФЖ аспирировали путем трансвагинальной пункции фолликулов через 34–35 ч после инъекции 5000–10 000 ЕД чХГ (Profasi, «Serono») и подготавливали по разработанной нами методике [3]. Сформировано несколько экспериментальных групп в зависимости от концентрации ФЖ в среде выделения: 1-я группа – подвижную фракцию спермиев из эякулята выделяли в среде Menezo B-2 без добавления ФЖ (контроль); 2-я группа – для выделения подвижной фракции использовали среду Menezo B-2 в сочетании с нативной ФЖ 9:1 (далее 10% ФЖ); 3-я группа – подвижную фракцию гамет выделяли в среде, содержащей нативную ФЖ и среду Menezo B-2 в соотношении 1:1 (далее 50% ФЖ). Результаты и обсуждение При выделении подвижной фракции спермиев из эякулята с использованием биологически активных сред (БАС) были получены следующие результаты (табл. 1). В контрольной группе мы выделили 77,9±6,25% активно подвижных спермиев, общее количество клеток после выделения составило 82,5±9,43 млн/мл. 2 группа – выделено 80,1±13,5 млн/мл сперматозоидов, из них 79,46±5,69% характеризовалось прямолинейным поступательным движением. В среде, содержащей 50% нативной ФЖ (3-я группа), 82,2±7,65% выделенных спермиев обладали быстрым прогрессивным движением (количество после выделения 84,77±5,34 млн/мл). Положительное воздействие на подвижность спермиев мы отмечали сразу же после добавления ФЖ человека. С увеличением концентрации ФЖ в среде выделения возрастало число сперматозоидов с признаками гиперактивации. Сперматозоиды характеризовались повышенной скоростью криволинейного движения и амплитудой латерального смещения головки на фоне уменьшения частоты прямолинейного движения. После инкубации спермиев в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С и 5% содержании СО2 в течение 1 ч кинетические характеристики спермиев изменялись следующим образом. В контрольной группе наблюдалось достоверное снижение активности гамет. Только 63,9±3,1% (р меньше 0,05) спермиев обладали быстрым прогрессивным движением, тогда как в группах с использованием в среде выделения ФЖ концентрация активно подвижных спермиев не снижалась, их движение характеризовалось поступательностью и прямолинейностью. После 24-часового культивирования спермиев в среде Menezo B-2 подвижными оставалось 30,5±1,9% спермиев. Добавление в эту среду ФЖ до 10 и 50% концентрации способствовало повышению переживаемости спермиев, которая возрастала с увеличением концентрации ФЖ в среде. Через 48 ч инкубирования наиболее высокая переживаемость спермиев (26,8±1,5%) наблюдалась в образцах с использованием 50% ФЖ. При хранении фракции спермиев в среде, содержащей 10% ФЖ, подвижными оставались 20,1±1,34% спермиев. Изучение переживаемости спермиев после 72-часового инкубирования в средах, содержащих и не содержащих ФЖ в разных концентрациях, позволило определить, что в 50% ФЖ подвижность сохраняло более 11% спермиев, что достоверно выше, чем в других исследуемых группах и контроле. В группах с 10% содержанием ФЖ подвижными оставались 4,6% спермиев, что достоверно выше, чем в контрольной группе (см. табл. 1). Таблица 1.
*р меньше 0,05 по сравнению с 1-й группой. Таким образом, ФЖ оказывает положительное влияние на переживаемость спермиев, поддерживая их двигательную активность более длительное время, чем общепризнанные БАС, в частности Menezo B-2. Стимулирующее влияние на подвижность спермиев во многих случаях отмечается сразу после добавления ФЖ к спермиям человека. Этот эффект, по-видимому, связан с наличием в ФЖ факторов, очевидно, стероидной структуры, способных быстро взаимодействовать с мужскими гаметами и стимулировать их биологическую активность [16]. Есть сообщения [12, 16, 17] о том, что ФЖ включена в модуляцию некоторых фундаментальных функций спермы, таких, как подвижность и акросомная реакция. Сохранности целостности гамет, повышению их переживаемости в родовых путях женщины in vivo и в культуре in vitro способствуют антирадикальные и антиоксидантные свойства ФЖ [2]. Одними из определяющих этапов метода ЭКО являются этапы оплодотворения яйцеклетки фертильными спермиями и культивирование эмбрионов. Оптимизация этих процессов может существенным образом повлиять на результативность лечения. В данной серии экспериментов оплодотворяющую способность спермиев изучали на 93 яйцеклетках, полученных у 16 пациенток (табл. 2). Таблица 2.
Примечание. В скобках – процент; * – р меньше 0,05 по сравнению с 1-й группой. Клетки были разделены на две группы. Первую группу (контроль) составили 43 яйцеклетки, аспирированные у 6 пациенток. Количество зрелых ооцитов составило 29 (67,5%). Зрелых с плотным кумулюсом – 7 (16,2%). Ооциты культивировали в среде Menezo B-2 от 4 до 6 ч в зависимости от степени зрелости. Инсеминацию проводили путем добавления 100 000 сперматозоидов на 1 ооцит. Фракцию спермиев с быстрым прогрессивным прямолинейным движением в 1-й группе получали методом «всплывания» в среде Menezo B-2. Через 16 ч после инсеминации контролировали наличие пронуклеусов. При их обнаружении зиготы для дальнейшего культивирования переносили в лунку, содержащую среду Menezo B-2. Ко 2-й группе отнесли 50 ооцитов, полученных у 5 женщин. Количество зрелых ооцитов составило 63,3%, зрелых с плотной короной радиата – 16,7%. Ооциты помещали в среду Menezo B-2, в которую добавляли активно подвижную фракцию спермиев, выделенную в 50% нативной ФЖ (2-я группа). При морфологической оценке ооцит-корона-кумулюсного комплекса не отмечено существенных различий в степени зрелости клеток в исследуемых группах. Оплодотворилось 30 (69,9%) ооцитов 1-й группы, 19 (63,3%) ооцитов 2-й группы, 8-клеточной стадии достигли соответственно 28 (93,33%), 18 (94,7%) эмбрионов. Оценка качества эмбрионов [4] позволила установить, что в 1-й группе 9 (30%) эмбрионов характеризовались как Grade 1 (отсутствие фрагментации, четкие, ровные бластомеры), во 2-й группе число таких эмбрионов было значительно выше и составило 13 (68,4%). Частота наступления беременности в 1-й группе составила 16,6%, тогда как в группе, где оплодотворение производили спермиями, выделенными в нативной ФЖ, этот показатель был 40%. Таким образом, оплодотворение ооцитов активно подвижными спермиями, выделенными в среде, содержащей ФЖ, заметно уменьшило число эмбрионов с признаками фрагментации и повысило частоту наступления беременности. Положительный эффект, по-видимому, можно объяснить следующим. По стандартной технике ЭКО ооциты тщательно отмывают от ФЖ и находящихся в ней клеток кумулюса и гранулезы и переносят в чистую среду, таким образом, искусственно нарушая взаимодействия между ними [4]. Между этими структурами имеются специальные мембранные контакты, являющиеся основой биохимической и электрической связи между клетками и способствующие взаимному обмену ионов и веществ с небольшой молекулярной массой [6]. Кроме того, ультрацитоплазматические исследования клеток кумулюса показали наличие в них стероидосинтетических клеток, которые играют роль в клеточном окружении делящегося эмбриона. ФЖ содержит клетки гранулезы, которые, как показано [6], способствуют капацитации спермиев, акросомальной реакции и пенетрации сперматозоидов через зону пеллюцида. Только в присутствии фолликулярных клеток происходит образование пирувата, который, в свою очередь, влияет на созревание ооцитов и необходим для роста эмбриона, а также первого и второго деления. ФЖ содержит большое число ростовых факторов [7], которые вовлекаются в процессы раннего эмбрионального развития, и ее присутствие в среде капацитации создает тот биохимический фон, который содействует синхронному дроблению и успешному развитию эмбрионов. Выводы
В.И. Грищенко, А.Г. Геродес, М.П. Петрушко, В.И. Пиняев, Н.Г. Грищенко Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины; Центр репродукции человека «Имплант», Харьков Литература 1. Ватев И., Табакова П., Диметров М. Суперовуляция и внутриматочная инсеминация обработанными сперматозоидами при лечении бесплодия. Первые результаты использования метода в городской акушерско-гинекологической больнице. Акуш и гин 1992; 8: 43–45. 2. Грищенко В.И., Геродес А.Г., Никитченко Ю.В., Петрушко М.П., Пиняев В.И. Роль антиоксидантной системы фолликулярной жидкости, нативной и хранившейся при низких температурах, в сохранении биологических свойств спермиев человека. Цитология 1999; 9: 182–183. 3. Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П. Влияние нативной и криоконсервированной фолликулярной жидкости человека на оплодотворяющую способность спермиев и развитие эмбрионов человека in vitro. Проблемы криобиологии 1999; 1: 45–46. 4. Элдер К., Эйвери С., Миллз К. IVF. Лабораторные процедуры. Bourn-hallam group 1990. 5. Erenus M., Zouves C., Rajamahendran P., Leung S., Fluker M., Gomel V. The effect of embryo quality on subsequent pregnancy rates after in vitro fertilization. Fertil Steril 1991; 56: 707–710. 6. Hamamah S., Lanson M., Barthelemy C., Garrigue M.A. et al. Treatment of human spermatozoa with follicular fluid can influence lipid content and motility during in vitro capacitation. Fertil Steril 1996; 65: 3: 265–271. 7. Hemmings R., Lachapelle M.H., Falcone T., Miron P., Ward L., Guyda H. Effect of follicular fluid supplementation on the in vitro development of human pre-embryos. Fertil Steril 1994; 62: 5: 1018–1021. 8. Junca A.M., Maldebaum J., Plahot M., Cohen J., Cohen I., Bacrie P. In vitro improvement of human sperm motility and fertilizing ability: (Abstr.) 2nd Jt Meet. ESHRE and ESCO, Milan, 1990. Hum Reprod 1990; Suppl. Abstr. 2nd Jt Meet ESHRE and ESCO 22. 9. Lambert H., Steinleihner A., Eisermann J. Enhanced gamete interaction in the sperm penetration assay after coicubation with pentoxifylline and human follicular fluid. Fertil Steril 1992; 58: 6: 1205–1208. 10. Mansour R., Aboulghar M.A., Serour G.I., Abbas A. Co-culture of human pronucleate oocytes with their cumulus cells. Hum Reprod 1994; 9: 9: 1727–1729. 11. Mendoza C., Tesarik J. Effect of follicular fluid on sperm movement characteristics. Fertil Steril 1990; 54: 1135–1139. 12. Mortimer D., Camenzing A.R. The role of follicular fluid in inducing the acrosome reaction of human spermatozoa incubated in vitro. Hum Reprod 1989; 4: 169–173. 13. Nichol R., Hunter R.H., de Lamirande E., Gagnon C., Cooke G.M. Motility of spermatozoa in hydrosalpingeal and follicular fluid of pigs. J Reprod Fertil 1997; 110: 1: 79–86. 14. Petrsen C. Guilhermino, Mauri A. Lucia, Campos M. Siste, Baruffi Ricardo L. Rasera, Franco J.J. Goncalves. Te’cnicas de capacitaca’’o esperm’atica. J bras ginecol 1992; 102: 6: 189–192. 15. Psalti J., Polet R., Bianchini W., Zoumaye E., Thomas K., Cooman S. Comparison of four different washing procedures to prepare spermatozoa for IVF: (Abstr.) 2nd Jt Meet. ESHRE and ESCO, Milan, 1990. Hum Reprod 1990; Suppl Abstr. 2nd Jt Meet ESHRE and ESCO 111. 16. Revelli G. Soldati. Effect of volumetric mixtures of peritoneal and follicular fluid from the same woman on sperm motility and acrosomal reactivity in vitro. Fertil Steril 1992; 57: 654–660. 17. Suarez S.S., Wolf D.P., Meizel S. Induction of the acrosome reaction in human spermatozoa by a fraction of human follicular fluid. Gamete Res 1986; 14: 107. 18. Yee B., Cummins L.M. Modification of the sperm penetration assay using human follicular fluid to minimize false negative results. Fertil Steril 1988; 50: 123–126. 19. Zhu J., Barratt C.L.R., Lippes J., Pacey A.A., Cooke I.D. The sequential effect of human cervical mucus, oviductal fluid, and follicular fluid on sperm function. Fertil Steril 1994; 61: 6: 1129–1135. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||