Влияние на фертильность хронической интоксикации с сероводородсодержащим газом.
|
Введение
Сероводород (регистрационный номер CAS 7783-06-4) входит наряду с другими менее токсичными компонентами в состав природного газа ряда газоконденсатных месторождений. Сероводород является побочным продуктом многих технологических процессов в нефтехимической промышленности, на коксохимических предприятиях, предприятиях по производству вискозного волокна, целлофана, солей бария, серосодержащих красок и пигментов, на фабриках по изготовлению литографий и фотогравюр, на сахарных и кожевенных заводах, на предприятиях по очистке сточных вод. Кроме того, сероводород применяется в качестве промежуточного продукта при синтезе неорганических и органических соединений серы [2]. Изучение острого отравления сероводородом, который относится к веществам II класса опасности, проводится достаточно широко, хотя случаев острого отравления сероводородом людей, к счастью, сравнительно немного. В то же время хроническому воздействию сероводородом подвергается значительное число людей, а работ, рассматривающих возможные последствия такого воздействия, крайне мало [11]. Вопрос о влиянии длительного воздействия малых доз сероводорода на важнейшую из биологических функций - репродуктивную функцию как в отечественной, так и в зарубежной литературе практически не освещен, хотя при пучении последствий воздействия химических веществ одной из приоритетных задач является оценка гонадотоксического действия [13, 16]. Газовый конденсат Астраханского месторождения отличается уникально высоким (более 30%) содержанием сероводорода, который является ведущим токсикантом среди других компонентов газового конденсата. Экспериментальное изучение влияния природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ) на репродуктивную функцию стало целью настоящей работы. Материалы и методы Беспородные белые 5-6-месячные крысы массой тела 180-240 г, содержавшиеся на стандартной диете, были разделены на две группы: контрольную (К) и опытную (О). В группу К вошло 59 животных (42 самки и 27 самцов), в группу О - 110 животных (46 самок и 64 самца). Животные группы О в течение 30 дней по 4 ч ежедневно подвергались воздействию природного газа АГКМ в камере для токсикологических экспериментов. Концентрация природного газа в атмосфере камеры поддерживалась на уровне 10 мг/м3 (доза 10 мг/м3 выбрана как соответствующая ПДК по сероводороду [14, 15]). После окончания затравки проводили спаривание животных в течение 20 дней: 19 самок К с 7 самцами К (1-я группа), 22 самки О с 8 самцами К (2-я группа), 23 самки К с 8 самцами О (3-я группа) и 24 самки О с 9 самцами О (4-я группа). Состояние сперматогенеза у самцов группы О оценивали по методу В.П. Маминой и Д.И. Семенова [6] каждые 7 дней в течение 35 дней после окончания воздействия сероводородсодержащего газа. Для повышения точности дифференцировки сперматогенных клеток проводили реакцию на гликоген [7]. Также каждые 7 дней в течение 35 дней исследовали суспензию эпидидимиса (учитывались общее количество, морфологические и кинетические характеристики, жизнеспособность эпидидимальных сперматозоидов) с использованием общепринятых методик [3, 12]. Определение числа клеток в счетной камере проводилось с учетом свойств распределения Пуассона [1]. Исследование выполнялось на микроскопе "Axioskop" с МC-80 фирмы "Karl Zeiss Jena GmbX". Как показывают наши исследования [4, 9, 10], определение активности ферментов является весьма информативным методом для оценки функционального состояния репродуктивной системы. Поэтому параллельно в гомогенате семенников определяли активность 3b-гидроксистероиддегидрогеназы (3b-ГСД) - одного из основных ферментов биосинтеза тестостерона. Для измерения активности 3b-ГСД применяли спектрофотометрический метод Рубина в модификации Голдмана [5]. Гомогенаты семенников после инкубации с 50 мкг дигидроэпиандростерона (3b-гидpoкcи-5-aндpocтeн-17-он) в 0,05 мл пропиленгликоля, 4,5 мкМ НАД и равными частями 0,9% раствора NaCl и 0,15 М фосфатного буфера рН 7,2 в постоянном объеме 2 мл. Подсчет образовавшегося продукта (4-кетостероидной формы) производили в этилацетатном экстракте инкубата при длине волны 302 нм, читали против стандартного раствора андростендиона (андростен-4-дион-3,17). Все измерения были продублированы трехкратно. Пустые пробы были подготовлены как опытные образцы, но без добавления субстрата. Активность 3b-ГСД выражали в условных единицах (усл. ед.). 1 усл. ед. = 1 мкг образовавшегося за 90 мин продукта / 1 г ткани семенника. Анализ полученных результатов произведен с использованием ПЭВМ "SUNRISE - Pentium-233MMX". Результаты и обсуждение Хроническое воздействие природного газа приводит к выраженному нарушению репродуктивного здоровья. Так, во 2-й группе количество мертворожденных увеличилось более чем в 5 раз (до 14,8±1,1%) по сравнению с 1-й группой (2,8±0,3%), а количество выживших в течение 10 дней постнатального периода снизилось (до 67,0±4,75%) по сравнению с 1-й группой. В 3-й группе нарушения были выражены более резко. Среднее число плодов снизилось в 2 раза (до 4,25±0,45) по сравнению с 1-й группой (8,6±0,85), количество мертворожденных возросло в 10 раз (до 29,4±0,95%) по сравнению с 1-й группой и почти в 2 раза по сравнению со 2-й группой. Количество выживших в течение 10 дней постнатального периода снизилось в 2 раза (до 35,3±1,2%) по сравнению с 1-й группой, т.е. число выживших в 3-й группе составило чуть больше одной трети от всех живорожденных. В 4-й группе наступление беременности не зарегистрировано, хотя рекреативное поведение животных было сохранено (табл. 1). Значительно более сильно пострадала репродуктивная функция самцов (3-я группа) по сравнению с самками (2-я группа), это побудило нас провести углубленное изучение влияния хронического воздействия природного газа на генеративную систему самцов. Таблица 1. Показатели репродуктивной функции крыс после хронического воздействия природного газа АГКМ
При анализе состояния сперматогенеза у крыс на 7-й день после прекращения воздействия сероводородсодержащего газа, отмечено резкое уменьшение общего количества сперматогенных клеток в семеннике - более чем в 7 раз (до 700±220 млн.) по сравнению с контролем (5236±470 млн. клеток). Постепенно происходило восстановление общего количества сперматогенных клеток (14-й день - 1890±290 млн., 21-й день - 3340±355 млн.), завершившееся к 28-му дню (5406±488 млн., табл. 2). Таблица 2. Состояние сперматогенеза у крыс в норме и после хронического воздействия природного газа АГКМ
Восстановление нормального соотношения между разными типами сперматогенных клеток (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды) происходило более медленно и завершилось к 35-му дню после окончания затравки (см. табл. 2). Исследование придатка семенника на 7-й день после окончания затравки показало снижение общего количества эпидидимальных сперматозоидов более чем в 1,5 раза (до 866±82 млн.) по сравнению с контролем (1425±155 млн.). Восстановление общего количества эпидидимальных сперматозоидов протекало достаточно быстро и заканчивалось к 14-21-му дню после окончания воздействия сероводородсодержащего газа (табл. 3). Таблица 3. Состояние эпидидимальных сперматозоидов у крыс в норме и после хронического воздействия природного газа АГКМ
При оценке состояния эпидидимальных сперматозоидов выявлены серьезные морфо-функциональные нарушения: резкое увеличение процентного содержания дефективных форм сперматозоидов, снижение подвижности, увеличение процентного содержания мертвых сперматозоидов. Так, на 7-й день, после окончания воздействия природного газа отмечалось увеличение количества сперматозоидов с морфологическими дефектами в 40 раз (до 44,4±3,8%) по сравнению с контролем (1,1±0,2%), подвижные сперматозоиды практически полностью отсутствовали (0,35±0,1%) по сравнению с контролем (88,0±6,2%). Также почти в 11,5 раз увеличивалось количество мертвых сперматозоидов (до 55,2±4,4%) по сравнению с контролем (4,8±0,82%). Восстановление изучаемых показателей происходило разными темпами. Если восстановление нормального количества живых сперматозоидов завершалось к 21-му дню (6,7±1,2% мертвых сперматозоидов), то восстановление количества подвижных сперматозоидов (76,8±8,4%) происходило к 35-му дню, а повышенное количество сперматозоидов с дефектами (3,9±0,7%) наблюдалось и на 35-й день после окончания воздействия природного газа (см. табл. 3). Определение тестостеронпродуцирующей активности семенников, т.е. функционального состояния клеток Лейдига [18, 19], показало снижение в семенниках активности 3b-ГСД на 7-й день после окончания воздействия природного газа более чем в 2 раза (до 102,0±22,5 усл. ед. по сравнению с контролем (236,2±29,3 усл. ед.). Восстановление активности 3b-ГСД до нормы происходило к 21-му дню (до 198,4±20,6 усл. ед.; (см. рисунок). Анализ полученных результатов позволил сделать некоторые выводы о механизмах гонадотоксического действия природного газа. В целом хроническое воздействие сероводородсодержащего природного газа крайне неблагоприятно сказывается на функциональном состоянии репродуктивной системы крыс, что подтверждается ухудшением генеративных показателей во 2-й и 3-й группах по сравнению с 1-й группой и инфертильностью в 4-й группе. Снижение среднего числа плодов у крыс 3-й группы обусловлено ухудшением оплодотворяющей способности эякулята после хронического воздействия природного газа. Субфертильность может проявляться нарушением нормального функционирования ферментативных систем спермоплазмы [4, 10] и (или) нарушением интерполимерного комплексообразования белками спермоплазмы [8, 9], обусловленным сероводородом и его метаболитами (сульфатами, тиосульфатами) [2], т.е. нарушением биохимического гомеостаза спермоплазмы. Также субфертильность может быть обусловлена нарушением генетического аппарата сперматозоидов, вызванным сероводородом и (или) его метаболитами. Подтверждением этому может служить, на наш взгляд, значительное увеличение количества мертворожденных и уменьшение количества выживших в течение 10 дней постнатального периода (см. табл. 1). Можно констатировать также наличие отдаленных последствий [13, 16] воздействия природного газа на крыс. Наряду с этим возможно отрицательное воздействие природного газа и его метаболитов па процесс сперматогенеза, на молекулярную структуру сперматозоидов и на метаболические пути биосинтеза основного тестикулярного гормона - тестостерона. Снижение общего количества сперматогенных клеток в семеннике свидетельствует о цитотоксическом действии сероводорода и (или) его метаболитов на сперматогонии. Однако это не может объяснить изменения соотношения между разными типами сперматогенных клеток. Причина такого дисбаланса, на наш взгляд, лежит в различной чувствительности звеньев сперматогенеза к воздействию токсиканта [16, 17]. Наиболее чувствительным является уровень образования сперматогонии А, который угнетается в начальные сроки хронического воздействия природного газа (блок I). Позднее происходит торможение процесса дифференцировки сперматид в сперматозоиды (блок II). Более устойчивым оказывается этап перехода сперматоцитов в сперматиды, который поражается к концу срока затравки (блок III). Молекулярные механизмы воздействия природного газа на процессы дифференцировки сперматогенных клеток остаются неизученными, и можно только предполагать взаимодействие сероводорода и (или) его метаболитов с рецепторным аппаратом клеток-мишеней. Единственным конкретным указанием на механизм действия сероводорода является резкое снижение активности 3b-ГСД, свидетельствующее о нарушение синтеза тестостерона, который в свою очередь контролирует несколько этапов процесса сперматогенеза, в частности редукционное деление мейоза [18, 19]. Интересно, что снятие блоков после окончания воздействия природного газа происходило, вероятно, в порядке, обратном времени их появления. Так, с 7-го по 14-й день после окончания затравки был снят сначала III блок, что совпадает с процессом восстановления нормальной активности 3b-ГСД. Затем был снят и II блок, в результате в 2 раза уменьшилось относительное количество сперматид за счет перехода в сперматозоиды (относительное содержание сперматозоидов возросло почти в 3 раза). К 21-му дню был снят I блок, что привело к увеличению относительного количества сперматогоний за счет увеличения возврата в стабильный пул сперматогоний типа А. Соотношение между сперматогониями, сперматоцитами, сперматидами и сперматозоидами, нарушенное воздействием природным газом, восстанавливалось только через 35 дней, хотя восстановление активности 3b-ГСД в среднем закончилось уже к 21-28-му дню после затравки. Возможно активность 3b-ГСД ингибируется сероводородом или его метаболитами, так как известна ингибирующая активность сероводорода по отношению к некоторым ферментам [2, 4], например, сероводород ингибирует цитохромоксидазу. Таким образом, хроническое воздействие природного газа приводит к ряду серьезных нарушений репродуктивной функции крыс, причем нарушения более выражены у самцов. Анализ полученных данных выявил несколько возможных механизмов гонадотоксического действия сероводорода и (или) его метаболитов. Хроническое воздействие природного газа приводит к отдаленным последствиям, связанным с поражением половых клеток. Субфертильность самцов может быть связана также с нарушением биохимического гомеостаза спермоплазмы. Сероводород и (или) его метаболиты способны оказывать цитотоксическое действие, вызывающее гибель сперматогоний, а также блокирующее воздействие на восполнение стабильного пула сперматогоний типа А, на процесс дифференцировки сперматид в сперматозоиды, на процесс мейоза (вероятнее всего на редукционное деление). Блок процесса мейоза, вероятно, связан с угнетением синтеза тестостерон, вызванным снижением активности фермента биосинтеза тестостерона 3b-ГСД, который ингибируется сероводородом и (или) его метаболитами. Д.Л. Луцкий, А.А. Николаев, Л.А. Гончарова, M.В. Ушакова Кафедра общей и биоорганической химии (зав. - доктор мед. наук, проф. А.А. Николаев), Астраханской государственной медицинской академии Литература 1. Бенюмович М.С. Определение числа клеток в счетной камере с учетом свойств распределения Пуассона. Клинич лаб диагностика 1997; 6: 11-12. 2. ВОЗ. Раннее выявление профессиональных болезней. Женева 1988. 3. Луцкий Д.Л., Николаев А.А. Морфологическое исследование эякулята: Методическое пособие. Астрахань 1999. 4. Луцкий Д. Л. Иммунохимическая и биохимическая характеристика спермоплазмы субфертильных мужчин: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Москва 2000. 5. Луцкий Д.Л., Ушакова М.В. Активность 3b-гидроксистероиддегидрогеназы семенников крыс как показатель сперматогенной функции при воздействии неблагоприятных экологических факторов. В кн.: Научная конференция НИИ и медицинских вузов Поволжья и Северного Кавказа: Тез докл. Нижний Новгород 2000; 21-22. 6. Маиина В.П., Семенов Д.И. Метод определения количества сперматогенных клеток семенника в клеточной суспензии. Цитология 1976; 7: 913-915. 7. Микроскопическая техника. Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. Москва 1996. 8. Николаев А.А., Аншакова Н.И., Алтухов С.А. Образование интерполимерных комплексов белками семенной плазмы. Вопр мед химии 1990; 4: 98-101. 9. Николаев А.А. Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человека: Автореф. ... д-ра мед. наук. Москва 1994. 10. Николаев А.А., Луцкий Д.Л., Бочановский В.А., ЛожкинаЛ.В. Активность ферментов спермоплазмы в эякулятах различной фертильности. Урол и нефрол 1997; 5: 35-39. 11. Николаев А.А., Луцкий Д.Л. Влияние экологических факторов на репродуктивную функцию мужчин. В кн.: Эколого-физиологические проблемы адаптации: Тез докл. Москва 1998; 79-80. 12. Николаев А.А., Луцкий Д.Л. Биологическое и биохимическое исследование эякулята: Методическое пособие. Астрахань 1999. 13. Нугис В.Ю., Строкина А.Н. Отдаленные последствия воздействия опасных и вредных экологических факторов на человека. В кн.: Воздействие на организм человека опасных и вредных экологических факторов: Том 2. Москва 1997; 350-420. 14. Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Под ред. Н.Ф. Измерова. Москва 1991. 15. Справочник предельно допустимых концентраций вредных веществ в пищевых продуктах и среде обитания. Под ред. М.П. Беляева. Москва 1993. 16. Bujan L. Environnement et spermatogenese. Contracept Fertil Sex 1998; 26(1): 39-48. 17. Hecht N.В. Molecular mechanisms of male germ cell differentiation. Bioessays 1998; 20(7): 555-561. 18. de Kretser D.М., Loveland K.L., MeinhardtA. et al. Spermatogenesis. Hum Reprod 1998; 13: 1-8. 19. Shan L.X., Bardin C.W., Hardy М.P. Immunohistochemical analysis of androgen effects on androgen receptor expression in developing Leydig and Sertoli cells. Endocrinology 1997; 138(3): 1259-1266 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||