Цитогенетическое исследование и микроделеционный анализ локусов AZF
|
Бесплодием страдает около 15% супружеских пар, при этом в 45-50% случаев оно связано с количественными или качественными нарушениями сперматогенеза. Примерно в 60% случаев причину патологии установить не удается. Несмотря на то, что этиологические факторы, приводящие к патологии сперматогенеза, остаются неизвестными, современные методы вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ), особенно ИКСИ в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов, позволяют преодолеть практически все формы мужского бесплодия. Однако в том случае, если причиной патологии является генетический фактор, наряду со снижением эффективности ЭКО велика вероятность его передачи потомкам. В последние несколько десятилетий благодаря применению цитогенетических и молекулярно-генетических подходов в решении проблем репродуктивной медицины удалось установить генетическую природу ряда форм мужского бесплодия.
К бесплодию у мужчин могут приводить аномалии кариотипа, микроделеции Y-хромосомы, поли- и моногенные наследственные болезни. Наиболее частые генетические причины нарушений сперматогенеза - численные и структурные хромосомные аберрации, а также микроделеции длинного плеча Y-хромосомы. Популяционные исследования показали, что частота хромосомных нарушений у мужчин с азооспермией составляет 10-15%, а с олигозооспермией - 4-7% [1]. В 7-30% случаев причиной необструктивной азооспермии и тяжелой олигозооспермии являются делеции эухроматинового района длинного плеча Y-хромосомы (Yq11) [2-9]. Впервые зависимость между нарушением сперматогенеза и терминальной делецией длинного плеча Y-хромосомы была продемонстрирована в 1976 г. При цитогенетическом исследовании у 1160 мужчин, страдающих бесплодием, обнаружено, что 6 из них имели делецию дистальной части длинного плеча Y-хромосомы [10]. Исследователи высказали предположение о том, что в дистальном участке эухроматина Yq11 располагается ген (гены), кодирующий фактор, необходимый для нормального сперматогенеза. В дальнейшем этот участок получил название "фактор азооспермии" - AZF. В начале 90-х годов благодаря построению физической карты Y-хромосомы на основе STS-маркеров стало возможным проведение рутинного микроделеционного анализа района Yq11 с целью поиска последовательностей ДНК, влияющих на сперматогенез [11, 12]. Микроделеционный ПЦР-анализ образцов ДНК, выделенной из крови бесплодных мужчин, позволил картировать в участке Yq11 три неперекрывающихся локуса: AZFа, AZFb и AZFc, делеции в которых сопровождаются нарушениями сперматогенеза различной степени тяжести [3]. В дальнейшем в каждом локусе был идентифицирован ген, предположительно считающийся "фактором азооспермии" - DFFRY (Drosophila Developmental gene Fast Facets) в AZFа, RBM (RNA-Binding Motif) в AZFb и DAZ (Deleted in Azoospermia) в AZFc [13-16]. За исключением очень редких случаев [17-19] делеции в участке Yq11 возникают de novo, в результате мутаций в клетках сперматогенного ряда, а возможно и позже на ранних стадиях развития эмбриона [20]. Следовательно, носители делеции в большинстве своем бесплодны и могут передать аномалию своего генотипа потомству только с помощью ВРТ. Использование для ЭКО сперматозоидов (сперматид) пациента с микроделецией локусов AZF не приведет к рождению ребенка с врожденными пороками развития, однако потомок мужского пола получит делецию, возможно, более протяженную (из-за "генетической нестабильности" Y-хромосомы) чем у отца, и поэтому будет иметь ту же или более тяжелую форму нарушения сперматогенеза [17]. Учитывая частоту встречаемости и наследственный характер делеций локусов AZF всемирные организации репродуктологов рекомендуют пациентам, для которых планируется проведение ИКСИ, наряду с генетическим консультированием и кариотипированием проведение микроделеционного анализа локусов AZF. Подобное тестирование проводится практически во всех развитых странах, однако в России репродуктологи практически не используют его в своей работе. В задачи настоящего исследования входило определение частоты встречаемости хромосомных аномалий и микроделеций в участке Yq11 у мужчин с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией неизвестной этиологии, являющихся кандидатами для проведения ИКСИ, и оценка состояния сперматогенеза у мужчин с генетическими аномалиями. Материал и методы В исследуемую группу вошли 32 пациента медицинского центра "АВА-ПЕТЕР", в возрасте от 24 до 40 лет, у которых согласно данным клинического и лабораторного исследований было диагностировано бесплодие неизвестного генеза. Анализ эякулятов, проводимый, по крайней мере, двукратно [21] и при необходимости анализ биоптатов яичка (проводилась множественная тонкоигольная биопсия), показал у 14 из них необструктивную азооспермию, у 1 - криптозооспермию (концентрация сперматозоидов в эякуляте меньше 1 млн/мл) и у 17 - тяжелую форму олигозооспермии (концентрация сперматозоидов в эякуляте меньше 5 млн/мл). Исследуемой группе пациентов планировалось проведение ИКСИ, при необходимости в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов. При проведении микроделеционного анализа использовали контрольную группу - 10 здоровых мужчин-доноров с кариотипом 46,XY, имеющих, по крайней мере, 1 ребенка. Кариотипирование: культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов метафазных хромосом проводили по стандартной методике [22]. Идентификацию Q-окрашенных (QFH) метафазных хромосом проводили в соответствии со стандартным кариотипом [23]. Выделение ДНК и микроделеционный анализ: выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили стандартным методом [24]. Для микроделеционного анализа локусов AZFa, AZFb, AZFc использовали метод мультиплексной ПЦР с 14 парами праймеров, фланкирующими STS-локусы, расположенные в участке Yq11 (делеционные субинтервалы 5 и 6) (табл. 1). Нами были использованы 4 мультисистемы для ПЦР со следующими парами праймеров: система 1 (sY85, sY125, sY153, sY182, sY269), система 2 (sY254, sY135, sY104, SY255, sY97), система 3 (sY143 sY82 sY116), система 4 (sY149, SRY, СYP1A1) (см. табл. 1). В систему 4 кроме маркеров субинтервала 6 были включены праймеры EA и EB, фланкирующие HMG бокс полдетерминирующего гена SRY (sY14), и праймеры СYP1, CYP2, фланкирующие фрагмент гена цитохрома (хромосома 15) в качестве дополнительного контроля амплификации. На первом этапе работы - для поиска микроделеций использовали системы 1, 2 и 4. В дальнейшем для уточнения границ микроделеций и дополнительного контроля результатов применяли систему 3 и ПЦР с праймерами sY159. При отсутствии амплификации какого-либо из фрагментов ПЦР проводили еще 2 раза, и при повторении результата определяли у пациента микроделецию. Положительный (образец ДНК мужчины-донора) и отрицательные (образец ДНК женщины, отсутствие ДНК) контроли ставили в каждом ПЦР-эксперименте. Таблица 1. Характеристика использованных в работе систем для мультиплексной ПЦР
ПЦР проводили в 25 мкл реакционного буфера (10 мМ Трис-HCl pH 8,3; 16,6 мМ сульфата аммония; 0,1% Tween-20), содержащего 100-200 нг геномной ДНК, 2 ЕД Taq-полимеразы, дНТФ (0,2 мМ каждого - дАТФ, дТТФ дГТФ дЦТФ), праймеры (10 пмоль каждого), 3 мМ MgCl2. После денатурации исследуемого образца ДНК проводили 30-35 циклов амплификации интересующих последовательностей (1 мин - 94 °С денатурация, 1 мин 30 сек - 58 °С отжиг праймеров, 1-2 мин - 72 °С синтез), реакцию заканчивали длительным синтезом - 10 мин - 72 °С. Для постановки ПЦР использовали программируемый термоциклер Cetus-Perkin (CША). Продукты амплификации разделяли в 7,5% акриламидном геле и визуализировали в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе. Количественный кариологический анализ (ККА) незрелых половых клеток (НПК) из яэкулята и биоптата яичка Приготовление препаратов НПК из эякулята и биоптата яичка, а также ККА незрелых половых клеток проводили согласно методу, разработанному Л.Ф. Курило и соавт. [25, 26], который позволяет оценить соотношение числа клеток сперматогенного ряда, находящихся на разных стадиях дифференцировки, и сравнив полученные данные с нормой (рассчитанной на большой выборке доноров спермы), определить, на какой стадии происходит блок сперматогенеза [25-26]. Препараты окрашивали красителем Hoechs 33258 и подсчитывали ядра НПК, находящихся на разных стадиях сперматогенеза. Учитывали также ядра (клетки) других типов (сперматозоиды, эпителиальные клетки, лимфоциты, клетки Сертоли). Долю НПК каждой из стадий вычисляли от общего числа проанализированных ядер НПК. Результаты Результаты цитогенетического исследования и микроделеционного анализа локусов AZF 32 пациентов с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией неизвестной этиологии представлены в табл. 2, 3. Таблица 2. Частота встречаемости аномалий кариотипа и делеций локусов AZF в исследованной группе пациентов
При анализе препаратов Q-окрашенных метафазных хромосом у 30 пациентов был установлен кариотип 46,XY, у 2 из них выявлен полиморфизм гетерохроматина длинного плеча Y-хромосомы: 46,XYqh+ (тяжелая олигозооспермия) и 46,XYqh- (криптозооспермия). У 2 пациентов с необструктивной азооспермией был установлен кариотип 47,XXY (см. табл. 2). При микроделеционном анализе локусов AZF у 2 пациентов с азооспермией и кариотипом 46,XY, а также у 1 пациента с криптозооспермией и кариотипом 46,XYqh- были обнаружены микроделеции в локусе AZFc, установлены границы микроделеций - интервал 6C - 6E (sY153- sY269) (см. табл. 2). У 1 пациента с азооспермией и кариотипом 46,XY была обнаружена микроделеция в локусах AZFc и b, границы микроделеции - интервал 6В - 6E (sY143- sY269) (см. табл. 2). У пациентов с олигозооспермией делеций не выявлено. Таблица 3. Характеристика состояния сперматогенеза пациентов с аномалиями кариотипа и делециями локусов AZF
Примечание. БсдП - блок сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы первого деления мейоза; БсС - блок сперматогенеза на стадии созревания сперматид; СII+С- доля сперматоцитов II и сперматид от общего числа проанализированных НПК (согласно [25-26], у мужчин с нормальным сперматогенезом эта доля составляет 91,99±0,89%). Чтобы лучше охарактеризовать состояние сперматогенеза у пациентов с аномалиями кариотипа и делециями локусов AZF был проведен ККА НПК из эякулята и/или биоптата яичка (в зависимости от доступности материала). Результаты исследования представлены в табл. 3. Было проанализировано не менее 400 НПК от пациентов К., П., И., Ш. и Ф. и 100 - от пацента М. У обоих пациентов с кариотипом 47,XXY был определен выраженный блок сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы, первого деления мейоза. Количество сперматоцитов II и сперматид у одного из них (К.) было в 5 раз, а у другого (П.) в 6,5 раза меньше, чем у мужчин с нормальным сперматогенезом. У пациентов И. и Ф. с делециями локуса AZFc также был выявлен блок сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы мейоза I. Количество сперматоцитов II и сперматид у пациента И. было незначительно ниже нормы, у пациента Ф. в 3 раза ниже нормы. У пациента Ш. с делецией локуса AZFc и у пациента М. с микроделецией, включающей локус AZFc и часть локуса AZFb (6B), был выявлен блок сперматогенеза на стадии созревания сперматид. Количество сперматоцитов II и сперматид у пациента Ш. было в 4,5 раза ниже нормы, а у пациента М. на 30% ниже нормального. Обсуждение В результате проведенных цитогенетического исследования и микроделеционного анализа локусов AZF у 32 пациентов с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией неизвестной этиологии генетическая природа патологии была выявлена в 6 случаях. С помощью традиционного цитогенетического исследования удалось установить причину нарушения сперматогенеза у 2 пациентов (синдром Клайнфельтера), а с помощью микроделеционного анализа локусов AZF еще у 4 пациентов. Результаты цитогенетического анализа обследованной группы не отличаются от полученных ранее в аналогичных работах [1]. Согласно данным, опубликованным разными исследователями, частота встречаемости микроделеции AZF-локусов у бесплодных мужчин варьирует от 1% [6] до 55,5% [27]. В среднем у мужчин с необструктивной азооспермией микроделеции встречаются в 15% случаев, а у мужчин с тяжелой олигозооспермией - в 6% случаев [2-5, 8, 9]. Эти различия отчасти могут отражать особенности генотипа разных этнических (географических) популяций и мутагенное влияние окружающей среды. Но прежде всего они объясняются различными подходами при отборе кандидатов для проведения анализа (формы бесплодия и параметры эякулятов обследуемых пациентов значительно различаются в разных исследованиях, не всегда анализ AZF-локусов проводят параллельно с кариотипированием). Благодаря гетерогенности исследованных групп и большому числу входящих в них пациентов в настоящее время можно достаточно четко сформулировать показания для микроделеционного анализа - необструктивная азооспермия, криптозооспермия и тяжелая олигозооспермия ( меньше 5·106 /мл) неизвестной этиологии. При подборе обследованной группы мы руководствовались вышеуказанными критериями, что объясняет большое число выявленных делеций. Микроделеции обнаружены у 3 из 12 пациентов с азооспермией и кариотипом 46,XY и у единственного (46,XYqh-) пациента с криптозооспермией. Отсутствие микроделеций у пациентов с тяжелой олигозооспермией можно объяснить малочисленностью выборки. Говоря о показаниях для проведения микроделеционного анализа локусов AZF, нужно отметить, что в некоторых публикациях сообщалось о редких случаях выявления делеций у пациентов с олигозооспермией (5-20·106/мл) и нормозооспермией [18, 27, 28]. Возможно, это точечные делеции, не влияющие на фенотип или варианты полиморфизма, для подтверждения этого нужны дальнейшие исследования на более многочисленных выборках. До сих пор существуют разногласия о расположении ряда STS-маркеров вдоль Y-хромосомы и числе маркеров для тестирования пациентов. Использование для анализа STS-маркеров, неверно расположенных на карте, может приводить к ошибочным результатам, поэтому использование большего их числа может предотвратить ошибки, но вместе с этим может привести к детекции клинически незначимых полиморфных вариантов [29]. Сообщалось, что количество маркеров, используемых для скрининга, хоть и незначительно, но влияет на частоту выявляемости делеций [29, 30]. Подбор STS-маркеров для микроделеционного исследования Yq11 важен для увеличения чувствительности и специфичности анализа. Учитывая вышеизложенное, мы использовали только те STS-маркеры, о специфичности которых сообщалось ранее в нескольких работах [3, 5, 8, 16, 31], и при этом использовали несколько маркеров для каждого локуса AZF (см.табл. 1). Наиболее часто, у 10-20% пациентов, страдающих бесплодием, микроделеции встречаются в локусе AZFc, включающем генное семейство DAZ [3, 5, 8, 16, 30]. В нашем исследовании у 3 из 4 пациентов была выявлена делеция локуса AZFc - 6C-6E (sY153- sY269) и у 1 пациента - локусов AZFc и b - 6В-6E (sY143- sY269) (табл. 3). Следует отметить, что у последнего пациента делетирован участок локуса AZFb, ограниченный субинтервалом 6В (sY143). Согласно исследованию экспрессии РНК-связывающего белка, кодируемого мультигенным семейством RBM, расположенным на обоих плечах Y-хромосомы, именно копии генов RBM-I, находящиеся в субинтервале 6В, являются необходимыми для экспрессии этого белка в клетках сперматогенного ряда [15]. Микроделеций в локусе AZFa, встречающихся лишь у 1-5% пациентов и преимущественно при необструктивной азооспермии [3, 6, 7, 13], нами не обнаружено. Изучение зависимости характера нарушения сперматогенеза от размера и положения микроделеции важно для понимания роли предполагаемых "факторов азооспермии" в процессе сперматогенеза. С этой целью исследователи ищут корреляции между результатами гистологического или цитологического анализа образцов ткани яичка и типом микроделеции. Результаты подобных исследований иногда противоречивы и взаимосвязи типов делеций и характера нарушений сперматогенеза до конца не ясны, однако уже сейчас можно сделать следующие выводы. Делеции локуса AZFa сопровождаются преимущественно синдромом только клеток Сертоли (СКС) типа I (полное отсутствие клеток сперматогенного ряда в семенных канальцах) или в редких случаях тяжелым гипосперматогенезом. Делеции локуса AZFc проявляются чаще блоком сперматогенеза, реже СКС типов I и II (присутствие незначительного числа клеток сперматогенного ряда в части семенных канальцев). Делеции локуса AZFb связывают с различными аномалиями сперматогенеза, в основном более тяжелыми, чем при делеции локуса AZFc [3, 4, 6-8, 13, 18, 30, 32]. Для оценки состояния сперматогенеза пациентов с делециями локусов AZF и аномалиями кариотипа кроме спермиологического анализа и микроскопического исследования биоптатов яичка мы использовали ККА НПК из эякулята и/или биоптата яичка (см. табл. 3). Согласно данным Л.Ф. Курило и соавт., при отсутствии обструкции семявыносящих протоков соотношение числа половых клеток разных стадий дифференцировки в биоптате яичка и эякуляте одинаково, что позволяет использовать этот неинвазивный метод в качестве альтернативы гистологическому (цитологическому) анализу образцов ткани яичка [26]. Кроме того, биоптаты, даже при множественной биопсии обоих яичек, не обязательно будут отражать состояние сперматогенеза в целом, а анализ эякулята даст возможность охарактеризовать морфофункциональный статус обоих яичек. Благодаря определенным для мужчин с нормальным сперматогенезом соотношениям НПК, находящихся на разных стадиях дифференцировки [25, 26], ККА НПК позволяет более точно, чем гистологическое (цитологическое) исследование, определить стадию, на которой произошел блок сперматогенеза. В нашем исследовании с помощью ККА НПК у 2 пациентов с делецией локуса AZFc был выявлен выраженный блок сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы первого деления мейоза. У 1 пациента с делецией локуса AZFc, а также у пациента с делецией локусов AZFc и b определили блок на более поздней стадии сперматогенеза - стадии созревания сперматид. У обоих пациентов с кариотипом 47,XXY был выявлен блок сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы мейоза I, что согласуется с результатами гистологических исследований биоптатов яичка пациентов с синдромом Клайнфельтера [33]. Исследование взаимосвязи типа микроделеции и степени нарушения сперматогенеза может иметь прогностическое значение для эффективности ВРТ. Ряд исследователей изучали непосредственно влияние типа делеций на результаты ТЕЗА и ТЕЗА-ИКСИ. Полученные данные коррелируют с выводами, сделанными при исследовании гистологических (цитологических) препаратов яичка пациентов с разными типами микроделеций. Показано, что в яичках примерно у 2/3 пациентов с делециями локуса AZFc могут быть обнаружены зрелые сперматозоиды, а при делециях локусов AZFa и AZFb практически все попытки ТЕЗА неудачны [34-38]. В нашем исследовании у 3 из 4 пациентов с микроделециями проводилась множественная биопсия обоих яичек (см. табл. 3). В биоптатах яичка пациентов И. с делецией AZFc и М. с делецией AZFc+b были обнаружены единичные неподвижные сперматозоиды, в последнем случае количество и морфология делали невозможным использование сперматозоидов для ИКСИ (см. табл. 3). В биоптате яичка пациента Ш. было обнаружено достаточное для проведения ИКСИ количество сперматозоидов, преимущественно подвижных с нормальной морфологией (см. табл. 3). Возможно, что на такой результат оказал влияние возраст пациентов. Ранее отмечалось, что состояние сперматогенеза мужчин с микроделециями локусов AZF прогрессивно ухудшается с возрастом [4, 30, 39]. Знание о наличии микроделеции в одном из локусов AZF объясняет причину нарушения сперматогенеза, помогает определить способ преодоления бесплодия и позволяет супружеской паре получить реальное представление о возможных нарушениях репродуктивной функции будущих детей. Супругам, желающим избежать рождения ребенка, страдающего бесплодием, можно рекомендовать преимплантационную диагностику с целью последующего переноса эмбрионов только женского пола. Если же супруги не придают значения подобным проблемам, их следует информировать, что степень нарушения сперматогенеза у будущего сына предсказать невозможно. Учитывая характерное для данной группы пациентов прогрессирующее ухудшение сперматогенеза, возможно, следует рекомендовать раннее андрологическое обследование потомства, раннее вступление в брак и/или криоконсервацию эякулята с целью последующего его использования для ЭКО. ВЫВОДЫ Полученные результаты еще раз подтверждают необходимость генетического обследования, включающего цитогенетическое исследование и микроделеционный анализ локусов AZF, пациентов с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией неясного генеза с целью установления причины бесплодия и выбора оптимальной тактики лечения. Учитывая высокую частоту встречаемости, наследственный характер и высокий риск передачи микроделеций потомству, молекулярно-генетический скрининг микроделеций в локусах AZF может быть рекомендован всем пациентам с бесплодием неясного генеза перед использованием ВРТ. Работа поддержана грантом РФФИ № 99-04-49599 Ю.А. Логинова, И.И. Нагорная, С.А. Шлыкова, М.В. Рыбакова, О.Г. Чиряева, Н.В. Корнилов, Т.В.Кузнецова Российско-Финская клиника "AVA-Peter", Институт акушерства и гинекологии им. Д. Отта РАМН, Санкт-Петербург Литература 1. Johnson M. Genetic risk of intracytoplasmic sperm injection in the treatment of male infertility: recommendations for genetic counseling and screening. Fertil Steril 1998; 70: 397-411. 2. Stuppia L., Mastroprimiano G., Calabrese G. et al. Microdeletions in interval 6 of the Y chromosome detected by STS-PCR in 6 of 33 patients with idiopathic oligo- or azoospermia. Cytogenet Cell Genet 1998; 72: 155-158. 3. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Y q11. Hum Mol Genet 1996; 5: 933-943. 4. Girardi S., Mielnik A and Schlegel P. Submicroscopic deletions in the Y chromosome of infertile men. Hum Reprod 1997; 12: 1635-1641. 5. Oliva R., Margarit E., Ballesca J. et al. Prevalence of Y chromosome microdeletion in oligospermic and azoospermic candidates for intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1998; 70: 506-510. 6. Foresta C., Ferlini A.,Garolla A. et al. High frequency of well-defined Y-chromosomal deletions in idiopathic Sertoli cell-only syndrome. Hum Reprod 1998; 13: 302-307. 7. Grimaldi P., Scarponi C., Rossi P. et al. Analysis of Yq microdeletons in infertile males by PCR and DNA hybridization techniques. Mol Hum Reprod 1998; 4: 1116-1121. 8. Ferlin A., Moro E., Garola A. and Foresta C. Human male infertility and Y chromosome deletions: role of the AZF-candidate genes DAZ, RBM and DFFRY. Hum Reprod 1999; 14: 1710-1716. 9. Krausz C., Bussani-Mastellone C., Granchi S. et al. Screening for microdeletions of Y chromosome genes in patients undergoing intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1999; 14: 1717-1721. 10. Tiepolo L. and Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet 1976; 34: 119-124. 11. Foote S., Vollrath D., Hilton A. et al. The human Y chromosome: Overlapping DNA clones spanning the euchromatic region. Science 1992; 258: 60-66. 12. Vollrath D., Foote S., Hilton A. et al. The human Y chromosome: A 43-interval map based on naturally occurring deletions. Science 1992; 258: 52-59. 13. Brown G., Furlong R., Sargent C. et al. Characterization of the coding sequence and fine mapping of the human DFFRY gene and comparative expression analysis and mapping to the Sxrb interval of the mouse Y chromosome of the DFFRY gene. Hum Mol Genet 1998; 7: 97-107. 14. Ma K., Inglis J., Sharkej A. et al. A Y chromosome gene family with RNA-binding protein homology: candidates for the azoospermia factor AZF controlling human spermatogenesis. Cell 1993; 75: 1287-1295. 15. Elliot D., Millar M., Oghene K. et al. Expression of RBM in the nuclei of human germ cells is dependent on a critical region of the Y chromosome long arm. PNAS 1997; 94: 3848-3853. 16. Reijo R., Lee T., Salo P. et al. Diverse spermatogenetic defects in human caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nature Genet 1995; 10: 383-393. 17. Stuppia L., Calabrese G., Franchi P. et al. Widening of a Y-chromosome interval-6 deletion transmitted from a father to his infertile son accounts for an oligozoospermia critical region distal to the RBMI and DAZ genes. Am J Hum Genet 1996; 59: 1393-1395. 18. Pryor J., Kent-First M., Mulhallem A. et al. Microdeletion in the Y chromosome of infertile men. N Engl J Med 1997; 336: 534-539. 19. Chang P., Sauer M., Brown S. Y chromosome microdeletion in a father and his four sons. Hum Reprod 1999; 14: 2689-2694. 20. Edwards R. and Bishop C. On the origin and frequency of Y chromosome deletions responsible for severe male infertility. Mol Hum Reprod 1997; 3: 549-554. 21. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge University press 1992. 22. Кузнецова Т.В., Логинова Ю.А., Чиряева О.Г. и др. Цитогенетические методы. Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Интермедика Ст-Петербург 1999; 2: 550-578. 23. ISCN 1995 An international system for Human Cytogenetic Nomenclature: Normal chromosomes. F.Mitelman (ed.) Cytogenet Cell Genet 1995; 5-26. 24. Иващенко Т.Э., Асеев М.В., Баранов В.С. Методы молекулярной диагностики генных болезней. Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Интериедика. Ст-Петербург 1999; 2: 603-617. 25. Курило Л.Ф., Дубинская В.П., Остроумова Т.В. и др. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам эякулята. Пробл репрод 1995; 3: 33-38. 26. Курило Л.Ф., Чеботарев А.Н., Шилейко Л.В. и др. Сравнительный анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их дифференцировки в биоптате яичка и эякуляте у пациентов с азоо- и олигозооспермией. Пробл репрод 1997; 1: 80-84. 27. van der Ven K., Montag M., Peschka B. et al. Combined cytogenetic and Y-chromosome microdeletion screening in males undergoing intracytoplazmic sperm injection. Mol Hum Reprod 1997; 3: 699-704. 28. Qureshi S., Ross A., Ma K. et al. Polimerase chain reaction screening for Y chromosome microdeletions: a first step towards the diagnosis of geneticall-determined spermatogenic failure in man. Mol Hum Reprod 1997; 2: 775-779. 29. Simoni M., Kamishke A. and Nieschlag E. Current status of the molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions in the work up of male fertility. Hum Reprod 1998; 13: 1764-1768. 30. Van Landuyt L., Lissens W., Stouffs K. et al. Validation of a simple Yq deletion screening programme in an ICSI candidate population. Mol Hum Reprod 2000; 6: 291-297. 31. Kostiner D., Turek P. and Reijo R. Male infertility: analysis of the markers and genes on the human Y chromosome. Hum Reprod 1998;13: 3032-3038. 32. Lee J.H., Lee D.R., Yoon S.J. et al. Expression of DAZ (deleted in azoospermia), DAZL1 (DAZ-like) and protamine-2 in testis and its application for diagnosis of spermatogenesis in non-obstructive azoospermia. Mol Hum Reprod 1998; 4: 827-834. 33. Бардин Л.У. Мужской гипогонадизм. Репродуктивная эндокринология. Пер. с англ. Под ред. И.И. Дедова. М: Медицина 1998; 2: 189-194. 34. Mulhall J., Reijo R., Alagappan R. et al. Azoospermic men with deletion of the DAZ gene cluster are capable of completing spermatogenesis: fertilization, normal embryonic development and pregnancy occur when retrieved testicular spermatozoa are used for intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1997; 12: 503-508. 35. Brandell R., Mielnik A., Liotta D. et al. AZFb deletions predict the absence of spermatozoa with testicular sperm extraction: preliminary report of a prognostic genetic test. Hum Reprod 1998; 13: 2812-2812. 36. Oates R. et al. The spectrum of spermatogenic deficiency in 20 men with Y interstitial microdeletions confined to the AZFc (DAZ) region. Poster, 16th Wold Congress on Fertility and Sterility. IFFS' 98 San Francisco, USA. 1988. 37. Silber S. et al. Y chromosome deletions in azoospermic and severy oligozoospermic men undergoing intracytoplasmic sperm injection after testicular sperm extraction. Hum Reprod 1998;13: 3332-3337. 38. Krausz C., Quintana-Murci L. and McElreavey K. Prognostic value of Y deletion analysis. Hum Reprod 2000; 15: 1431-1434. 39. Simoni M., Gromoll J., Dvorniczak B. et al. Screening for deletions of the Y chromosome involving the DAZ (Deleted in Azoospermia) gene in azoospermia and severe oligozoospermia. Fertil Steril 1997; 67: 542-547 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||