Электронно-микроскопическое изучение сперматозоидов человека.
Разработка схемы комплексного обследования для проведения дифференциальной диагностики мужского бесплодия является определяющим моментом для выбора адекватных методов терапии. Если абстрагироваться от анатомических и иммунологических причин инфертильности мужчин и рассматривать процесс оплодотворения на клеточном уровне, то можно выделить две основные причины неудач:
В первом случае для прогноза фертильности достаточно подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов в 1 мл эякулята, что выявляется при рутинном лабораторном исследовании эякулята на светооптическом уровне (семиологический анализ). Нарушение функциональных свойств сперматозоидов при обычном светомикроскопическом исследовании в ряде случаев обнаружить невозможно. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с ооцитом разработан ряд функциональных тестов. Среди таких тестов можно назвать акросомную реакцию, тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита (HZA - hemizona assay) [1]; тест проникновения сперматозоидов сквозь блестящую оболочку ооцита [2]; тест проникновения сперматозоидов в ооцит, лишенный оболочки [3]; определение деконденсации хроматина ядра сперматозоида методом окраски анилиновым синим [4]. Наряду с этими тестами для установления этиологии и патогенеза патозооспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа. Для успешного оплодотворения ооцита и дальнейшего ее дробления in vivo сперматозоиду необходимы:
Электронно-микроскопические исследования позволяют провести качественную и количественную оценку состояния клеточных органелл сперматозоида, участвующих в выполнении этих функций, и в ряде случаев определить причину их функциональных нарушений [6]. Так, в прогнозировании успешного проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) ключевыми могут быть сведения об ультраструктуре головки и акросомы сперматозоидов [6]. Процесс сперматогенеза представляет собой сложную многостадийную цепь дифференцировки мужских гамет, контролируемую сотнями генов и находящуюся под влиянием множества внутренних и внешних факторов. Именно поэтому каждый клинический случай нарушения сперматогенеза является уникальным и требует индивидуального подхода для выбора специфической терапии и возможности прогнозирования наступления беременности и ее исхода и в ряде случаев - прогноза генетического здоровья потомства. Структура нормальных сперматозоидов Сперматозоиды человека не являются однородной популяцией. Согласно Руководству ВОЗ по спермиологическим исследованиям [7], в эякуляте фертильного мужчины должно содержаться не менее 30% морфологически нормальных сперматозоидов. Остальные 70% могут составлять атипичные формы, среди которых встречаются формы с аномалиями головки, шейки и жгутика в различном количественном соотношении. У пациентов с диагнозом "тератозооспермия" часто преобладает какая-либо одна форма патологии сперматозоидов. В норме зрелые сперматозоиды человека имеют плоскую овальную головку с хорошо различимой акросомой, занимающей 40-70% площади головки (рис. 1). В некоторых случаях головка может быть слегка заострена в постакросомном районе. Длина головки сперматозоида достигает 3-5 мкм, толщина 2-3 мкм. Средний отдел жгутика гладкий, его длинная ось совпадает с длинной осью головки сперматозоида (аксиальное прикрепление), толщина менее 1 мкм, длина примерно в 1,5 раза больше длины головки. В среднем отделе жгутика может быть видна цитоплазматическая капля (остаток цитоплазмы сперматиды), размер которой не должен превышать половины площади головки. Основной отдел жгутика однороден по толщине, немного тоньше средней его части. Жгутик не должен быть закрученным, его длина достигает примерно 45 мкм [8, 9]. Именно такие сперматозоиды составляют большую часть клеточной популяции в верхних отделах шейки матки после коитуса, т.е. именно такие сперматозоиды преодолевают ряд функциональных презиготических фильтров и способны к оплодотворению.
Рис. 1. Ультраструктура нормальных сперматозоидов в сканирующем (а) и трансмиссионном (б) электронном микроскопе. * 10 000. Г - головка; Ш - шейка; А - акросома; Я - ядро с конденсированным хроматином; Ц - цитоплазматическая капля. Функциональная анатомия и аномалии ядер сперматозоидов человека Головка сперматозоида состоит из ядра с плохо различимой ядерной оболочкой и гомогенной, плотно упакованной массой хроматина. Такая структура ядра мужской гаметы является результатом физико-химической и морфологической трансформации, которая осуществляется на поздней стадии сперматогенеза и продолжается во время прохождения сперматозоидов через придаток яичка. При этом происходит элиминация РНК [10], замещение соматических гистонов протаминами, богатыми аргинином [11, 12], образование между протаминами дисульфидных мостиков, обусловливающих стабильность хроматина, что является завершающим этапом дифференцировки [13]. Тонкогранулярный хроматин сперматид ранних стадий постепенно превращается в компактный плотно конденсированный хроматин зрелых сперматозоидов [14]. Ядра зрелых сперматозоидов устойчивы к различным внешним воздействиям, в том числе и к бактериальным токсинам. У большинства видов млекопитающих замещение гистонов протаминами в головках сперматозоидов является полным, у человека около 15% гистонов остается ассоциированными с ДНК сперматозоидов, при этом участки нуклеогистонов чередуются с участками нуклеопротаминов [15]. У морфологически зрелых сперматозоидов хроматин представляет собой гомогенную гиалиноподобную массу. Аномальная конденсация хроматина при электронно-микроскопическом исследовании выражается в наличии грубогранулярного ядерного вещества, характерного для сперматид на стадии удлинения ядер [5, 12]. Для таких ядер употребляется термин "незрелый хроматин". ДНК ядер с незрелым хроматином менее устойчива к денатурации [16], описана связь низкой степени конденсации хроматина с наличием в гамете хромосомных аберраций [17] и с высоким содержанием тестис-специфических гистонов, незамещенных протаминами [18]. У бесплодных пациентов выявлен высокий уровень предшественников протаминов [19]. Имеется связь между нарушениями организации хроматина сперматозоидов и их способностью к оплодотворению [20], а также определено влияние организации хроматина на развитие эмбрионов после ЭКО [21]. У лиц с идиопатическим бесплодием электронно-микроскопически показано значимое увеличение количества сперматозоидов со сниженной степенью конденсации хроматина [17, 22]. Пациент Р. Обратился в медико-биологический центр "Пастер" для первичного обследования по поводу бесплодного брака. Результаты спермограммы: концентрация сперматозоидов 11·106, подвижность a+b 20%, cперматозоиды нормальной морфологии - 30%, незрелые половые клетки (НПК) - 10%. Диагноз: олигоастенозооспермия I степени,. При ультраструктурном анализе в ядрах 85% сперматозоидов выявлен незрелый хроматин (рис. 2), такой же характер конденсации хроматина в изученных НПК.
Рис. 2. Ультратонкий срез через ядро (Я) сперматозоида, содержащее гранулированный ("незрелый") хроматин и вакуоли (В). * 42 000. А - акросома. Функциональная анатомия и дефекты строения акросомы сперматозоидов человека При светооптических исследованиях на переднем конце ядер сперматозоидов выявляется так называемая ядерная шапочка, или акросома. Последняя является производной аппарата Гольджи, что было впервые показано R.Bowen [23]. При формировании акросомы несколько проакросомных гранул сливаются в одну большую гранулу, которая контактирует с ядерной оболочкой. Она распластывается на поверхности ядра и формирует "шапочку", занимающую 25-60% ядерной поверхности. В этот период гликопротеины переносятся из комплекса Гольджи в акросому посредством мембранных пузырьков [24]. Акросома зрелого сперматозоида содержит лизосомные ферменты [24], необходимые для пенетрации сперматозоидами фолликулярных клеток яйценосного бугорка и прозрачной оболочки яйцеклетки [25]. Оценка аномалий головки сперматозоидов и акросомы обычно проводится при помощи специальных методов окраски [26] либо функциональных тестов [27]. Эти методы визуализируют наличие акросомной реакции и позволяют дифференцировать истинную акросомную реакцию от ложной. Первая является результатом капацитации, вторая - следствием дегенеративных изменений сперматозоидов. При ультраструктурном исследовании выявляются такие дефекты строения акросомы, которые не определяются при светооптических методах исследования: деформация акросомы (рис. 3), отхождение ее от ядра, Т-образные акросомы двуядерных сперматозоидов, дупликации акросомы, наличие внутриакросомных вакуолей. Подобные дефекты описаны у пациентов с бесплодием и отрицательными тестами пенетрации сперматозоидами пациента ооцитов золотистого хомячка [28]. При этом анализы проб эякулята на светооптическом уровне позволяли выявлять количество, подвижность и морфологию сперматозоидов, соответствующие нормальным параметрам [29].
Рис. 3. Ультратонкий срез через ядро сперматозоида с деформированной акросомой (А). * 46 000. В расширенном периакросомальном пространстве - мембранная вакуоль (В). Глобулозооспермию (округление головок сперматозоидов) часто связывают с полным отсутствием акросомы [30, 31]. Деструктивные изменения сперматозоидов, которые, как предполагают, могут быть обратимы, описаны у наркоманов [32]. Пациент К. Обратился в МГНЦ РАМН по поводу бесплодия. Определен кариотип 46,ХY. Анализ гормонов в крови показал, что уровень ЛГ, ФСГ и тестостерона находится в пределах нормы, уровень пролактина повышен в 2-3 раза. Концентрация сперматозоидов за период с 1988 по 1996 г. колебалась от 35 до 180 млн/мл. В 1996 г. в одной из проб эякулята концентрация сперматозоидов не превышала 7 млн/мл, активная прогрессивная подвижность сперматозоидов (a+b) составляла 9 - 13%, выявлена 100% глобулозооспермия. Диагноз: тератозооспермия. Количественный кариологический анализ клеточного состава эякулята по стадиям развития НПК [33, 34] свидетельствовал о частичном блоке сперматогенеза на стадии пахитены и диплотены профазы I мейоза. Доля неидентифицированных НПК была ниже контрольного уровня, что свидетельствовало об отсутствии интенсивной дегенерации клеток сперматогенного эпителия и о физиологическом течении сперматогенеза. При ультраструктурном анализе [35] была выявлена характерная триада признаков - тотальный агенез акросомы, гранулярный "незрелый" хроматин, округлая форма головок (рис. 4). Выявлены также аномалии локализации митохондрий. Заключение: тотальный агенез акросомы, глобулозооспермия, незрелость хроматина, нарушение локализации митохондрий.
Рис. 4. Ультратонкий срез эякулята пациента К. с глобулозооспермией. * 14 000. Сперматозоиды с округлыми головками, в ядрах (Я) гранулярный ("незрелый") хроматин (Х). Акросома отсутствует. М - митохондрии; Ц - цитоплазматическая капля; Ж - аксонема закрученного в цитоплазме жгутика. Пациент Т. обратился в медико-биологический центр "Пастер" для первичного обследования по поводу бесплодного брака в течение 3 лет. Результаты спермограммы: концентрация сперматозоидов 32·106, подвижность сперматозоидов (а+b) 44%, морфологическая атипия (микроцефалия и глобулозооспермия) выявлена у 95% сперматозоидов. На уровне светооптической микроскопии установлено, что сперматозоиды имели округлые мелкие головки. По спермограмме был поставлен диагноз: тератозооспермия (глобулозооспермия). При ультраструктурном анализе сперматозоиды были описаны как микроцефалические с уплощенной передней частью головки и акросомой неправильной формы (рис. 5). Заключение: глобулозооспермия, не связанная с агенезией акросомы.
Рис 5. Ультратонкий срез эякулята пациента Т. с глобулозооспермией. * 35 000. Микроцефалический сперматозоид с уплощенным передним полюсом ядра, зрелым хроматином и неправильной формы акросомой (А). Пациент П. обратился в МГНЦ РАМН по поводу бесплодия. Определен нормальный мужской кариотип - 46,ХY. Согласно результатам спермограммы, концентрация сперматозоидов достигала 48·106, 100% глобулоспермия. При кариологическом анализе НПК эякулята определена доля неразошедшихся сперматид - 7,4%. При электронно-микроскопическом исследовании 76 сперматозоидов показано, что 78% сперматозоидов имели нормальную акросому в виде плоской цистерны на апикальном конце ядра, однако эта часть ядра имела неправильную форму в отличие от овальной формы нормальных сперматозоидов. Заключение: глобулозооспермия, микроцефалия, нарушение формы акросомы. Таким образом, у пациента К. обнаружен синдром округлых головок и полная агенезия акросомы (глобулозооспермия), у пациентов Т. и П. атипия головки (глобулозооспермия) не сопровождалась агенезией акросомы. Данные электронно-микроскопического изучения клеток эякулята пациентов с синдромом округлых головок сперматозоидов свидетельствуют о том, что существуют два подтипа головок [36, 37]. Один подтип - сперматозоиды при истинном синдроме округлых головок, характеризующиеся полной потерей акросомы и деконденсированным хроматином. В аксонеме и жгутике таких сперматозоидов микротрубочки и митохондрии часто аномальны [38]. При втором подтипе округлых сперматозоидов также определяется аномальное распределение хроматина, но акросома формируется [37]. В данных случаях акросомная реакция может быть не нарушена [39]. Так как имеются публикации о семейных случаях синдрома округлых головок сперматозоидов [14, 40], предполагается генетическая природа данной патологии. V. McKusick и соавт. [41] допускают возможность аутосомно-доминантного, S. Florke-Gerloff и соавт. [42] - полигенного наследования. Характер аномалии ультраструктуры сперматозоидов, по-видимому, зависит от типа мутации соответствующих генов и степени их экспрессии. Агенезия акросомы приводит к необратимому бесплодию. J. Liu и соавт. [43] показали, что беременность может наступить у половых партнерш пациентов с глобулозооспермией лишь при использовании интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ). Так как при ИКСИ отсутствует селекция гамет, важно определить степень риска переноса потомству генетического дефекта [44]. D. Carrel и соавт. [40] показали, что у пациентов с глобулозооспермией частота анеуплоидии в половых клетках выше по сравнению с контрольной группой. Эти данные заставляют с осторожностью подходить к включению пациентов с глобулозооспермией, обусловленной агенезией акросомы, в программу ИКСИ. Функциональная анатомия и дефекты строения жгутиков сперматозоидов Жгутик сперматозоида разделяется на шейку, средний, основной и концевой отделы. Морфологическую основу жгутика составляет аксонема, состоящая из микротрубочек, организованных по универсальной схеме 9+2 (рис. 6, а, б), характерной для большинства типов ресничек и жгутиков клеток эукариотических организмов [45]. Аксонема тянется вдоль всей длины жгутика. В среднем отделе аксонема жгутика окружена слоем из 9 дополнительных фибрилл (9+9+2), кнаружи от которых расположены митохондрии. В основном отделе они заменяются фиброзным слоем, в концевом отделе остается только аксонема [5, 46].
Рис. 6. Схематическое изображение аксонемы жгутика нормального сперматозоида на поперечном срезе (а). Ультратонкие поперечные срезы через основной участок жгутика пациента с нормозооспермией (б) и сперматозоида пациента Б. с астенозооспермией (в). * 145 000. В аксонеме жгутика сперматозоида на рис. 6, в полностью отсутствуют динеиновые ручки периферических дуплетов микротрубочек. Шейка сперматозоидов. Центриолярный комплекс и аксонема формируют соединительный участок, или шейку, соединяющую головку сперматозоида и жгутик. Шейка сперматозоида имеет сложное строение. На тотальном препарате она выявляется как утолщение жгутика. У сформированного сперматозоида шейка представляет собой усеченный конус, содержащий проксимальную и измененную дистальную центриоли (рис. 7, а). Усеченный конус шейки на уровне дистальной центриоли состоит из 9 удлиненных поперечно исчерченных столбиков. Эти столбики напротив центриолярного отростка сливаются, теряют индивидуальные очертания и совместно продолжаются по направлению к головке, сливаясь с базальной пластинкой, лежащей у основания имплантационной ямки.
Рис. 7. Схематическое изображение шейки сперматозоида (а) и ультратонкий срез (б) через шейку нормального сперматозоида. * 13 000. М - митохондрии. Центриоли человека, также как и некоторых видов млекопитающих (овец, коров, сумчатых) наследуются через отцовские половые клетки [47-50] и после оплодотворения становятся основой формирования астросферы спермия [50-52]. В ооциты человека при оплодотворении переносится проксимальная центриоль сперматозоидов [53]. Авторы показали, что на ранних этапах дробления зиготы астросферa спермия остается связанной с остатками аксонемы жгутика. Функциональный центр образования микротрубочек астросферы спермия человека связан с центриолями сперматозоидов. Так, у диспермических зигот формируются трехполюсные веретена дробления [53]. A. Sathananthan [54] высказал гипотезу о том, что если дефектные центриоли сперматозоидов наследуются эмбрионом при оплодотворении, они могут приводить к аномальному дроблению и развитию аномальных эмбрионов. Нет прямых доказательств этой гипотезы у человека. Известны spe мутанты Chlamydomonas elegans [55] и некоторые мутанты Drosophila с отцовской стерильностью [56], которая обусловлена дефектами отцовских центросом. Естественные вариации строения центросом сперматозоидов коррелируют с репродуктивными способностями быков in vivo и при искусственном осеменении [57]. Эти данные являются доводами в пользу гипотезы A. Sathananthan о роли аномального строения центриоли сперматозоида в возникновении патологии плода человека. При ультраструктурном изучении клеток эякулята человека мы наблюдали двухвостые сперматозоиды с двумя проксимальными центриолями у основания. В двуядерных сперматидах эякулята мы обнаруживали 2 пары не разошедшихся в делении созревания центриолей (рис.8). Возможно, что нерасхождение центриолей может быть причиной аномалий развития, приводящих к полиплоидизации клеток плода и к самопроизвольному прерыванию беременности [58].
Рис. 8. Двуядерная сперматида на ультратонком срезе. * 42 000. Я - ядра; Ц - материнские центриоли; Д - лочерние центриоли; М - митохондрия. Аномалией строения шейки является наличие остаточных цитоплазматических капель, размер которых превышает величину головки (рис. 9) [7]. К патологическим изменениям шейки сперматозоидов относят гетероаксиальность - те случаи, когда головка сперматозоида и жгутик расположены под углом друг к другу. Мы описали две морфологические картины гетероаксиальности. При отклонении головки от оси симметрии на угол менее 90° видна асимметрия самой головки с сохранением ультраструктурных компонентов шейки (рис. 10). При более выраженном отклонении головки от оси симметрии (более 90°) структуры, обусловливающие контакт шейки и головки (базальная пластинка, сегментированные столбики, capitulum), могут не выявляться (рис. 11).
Рис. 9. Сперматозоид с цитоплазматической каплей на шейке (Ц) и закрученным в цитоплазме жгутиком (Ж) в сканирующем (а) и трансмиссионном (б) электронном микроскопе. * 9 000. Я - ядро; А - акросома.
Рис. 10. Сперматозоид с гетероаксиальностью (отклонение головки (Г) от оси симметрии менее 90°) в сканирующем (а; * 20 000) и трансмиссионном (б; * 35 000) электронном микроскопе. Я - ядро; А - акросома; СС - сегментированные столбики; Ф - дополнительные фибриллы средней зоны жгутика; Ц - проксимальная центриоль; М - митохондрии.
Рис. 11. Сперматозоид с гетероаксиальностью (отклонение головки (Г) от оси симметрии более 90°) в сканирующем (а; Ѕ 8000) и трансмиссионном (б; Ѕ 36 000) электронном микроскопе. В зоне шейки наблюдается проксимальная центриоль (Ц), остальные структуры соединительного участка отсутствуют. Средний и основной отдел жгутика. При ультраструктурном анализе половых клеток эякулята с помощью ряда морфологических критериев можно четко отличить астенозооспермию, вызванную некрозооспермией (по таким несомненным признакам, как фрагментация плазматической мембраны, дегенеративные изменения акросомы, кариолизис и кариорексис) от астенозооспермии, являющейся результатом генетически обусловленных патологических изменений жгутиков сперматозоидов [59], и от астенозооспермии, вызванной преходящими функциональными изменениями митохондрий (просветление матрикса митохондрий, набухание их крист) [60]. Морфологические аномалии различных компонентов аксонемы жгутиков некоторой части сперматозоидов могут встречаться у фертильных пациентов, однако значительные нарушения подвижности сперматозоидов коррелируют со структурными дефектами аксонемы жгутиков всех сперматозоидов или их большей части. Проведение количественного анализа морфологических аномалий аксонемы имеет прогностическое значение у пациентов с астенозооспермией [60]. Наиболее частым дефектом строения аксонемы является отсутствие одной или обеих центральных микротрубочек (дефект 9 + 1 или 9 + 0) [8], что выражается в значительном уменьшении или полном отсутствии подвижности сперматозоидов. Достаточно часто встречаются такие аномалии аксонемы, как: 1) отсутствие динеиновых ручек около периферических дуплетов микротрубочек (и наружных и внутренних, либо только наружных или только внутренних) [61]; 2) дезорганизация какого-либо периферического дуплета [62]; 3) отсутствие радиальных спиц аксонемы [59, 63]. Проведение количественного электронно-микроскопического анализа показало, что в группе пациентов со значительно сниженной подвижностью сперматозоидов (менее 20% подвижных) нарушения ультраструктуры различных аксонемных элементов встречаются значительно чаще [64]. Примерно в 50% случаев такие нарушения встречаются в сочетании с классической триадой синдрома Картегенера - хронические синуситы, бронхоэктазы, situs viscerum inversus [65]. В некоторых случаях, но не всегда, мужчины с синдромом Картагенера бесплодны [66, 67]. В литературе имеются сообщения о наличии подвижных сперматозоидов у мужчин с отсутствием динеиновых ручек в ресничках клеток эпителия дыхательных путей [68], и, наоборот, об изолированных дефектах только жгутиков сперматозоидов без патологии клеток реснитчатого эпителия [69]. По-видимому, аксонемная организация жгутиков и ресничек находится под контролем различных генов. Недавно было показано на мышах, что один из генов Т-локуса хромосомы 17 может кодировать легкие цепи динеина наружных ручек аксонемы [70]. Т- локус обнаружен также у человека, можно предположить его участие в развитии синдрома Картагенера [71]. Структурные аномалии дополнительных фибрилл встречаются реже, чем аномалии аксонемы, и могут выражаться в изменении их формы, уменьшении количества или топографических нарушениях [28]. С помощью негативного контрастирования показано, что в группе пациентов с астенозооспермией аномалии дополнительных фибрилл встречаются статистически достоверно чаще [72]. Нарушения митохондриального слоя среднего отдела жгутиков при астенозооспермии могут быть выражены в различной степени - от уменьшения количества или нарушения спиральной упаковки митохондрий до полного их отсутствия [28]. Количественные изменения в строении митохондриального листка могут развиться вследствие генных мутаций. Однако в ряде случаев у больных с астенозооспермией и инфекционными процессами урогенитального тракта выявляются качественные изменения - набухание крист и просветление матрикса митохондрий, что является обратимым процессом и, возможно, связано с воспалительной реакцией, в том числе с высокой концентрацией лейкоцитов в эякуляте. Пациент Б. Обратился в МГНЦ РАМН по поводу бесплодия. Определен кариотип 46,ХY; анализ концентрации гормонов в крови показал некоторое повышение уровня ЛГ при нормальном уровне ФСГ и пролактина. Данные спермограммы: концентрация сперматозоидов 30,4·106, подвижность типа b 2,5%, атипия сперматозоидов 68%. Заключение: астенозооспермия. Проведенный количественный кариологический анализ состава по стадиям развития НПК из эякулята позволил определить частичный блок сперматогенеза на стадиях лептотены и зиготены профазы I мейоза и повышение числа неразошедшихся при делениях созревания сперматоцитов и сперматид. При ультраструктурном анализе на строго поперечных срезах жгутиков сперматозоидов просмотрено 8 клеток [73]. На всех препаратах обнаружено отсутствие наружных и внутренних динеиновых ручек аксонемы (см. рис. 6, в). Заключение: тотальное отсутствие динеиновых ручек аксонемы, которое является причиной астенозооспермии. Пациент Ш. Обследовался по поводу бесплодия в медицинском центре "Консуэло". Данные о результатах спермограммы отсутствуют. При электронно-микроскопическом изучении 36 сперматозоидов показано, что ядра 75% сперматозоидов вакуолизированы, в 5% сперматозоидов выявлен незрелый хроматин. В средней зоне жгутика обращает на себя внимание строение митохондрий - практически все митохондрии, расположенные вокруг аксонемы, имели электронно-прозрачный матрикс и расширенные кристы. Заключение: вакуолизация ядер и функциональные изменения матрикса и крист митохондрий. В настоящее время адекватная диагноcтика синдрома Картагенера проводится только с помощью электронно-микроскопических методов [74]. Презиготический характер мутации устанавливается по клиническим признакам и по изучению родословной пациента. У данного пациента в родословной фигурировала частичная аносмия, что позволило поставить предположительный диагноз синдрома Картагенера. Сперматозоиды с дефектами строения аксонемы не способны проходить через женские половые пути и достигать верхних отделов маточных труб, однако они дают акросомную реакцию и пенетрируют ооциты. Таким образом, сперматозоиды с дефектами аксонемы могут участвовать в оплодотворении in vitro [75, 76]. При отсутствии наружных динеиновых ручек благоприятный прогноз деторождения возможен только при ИКСИ. Вывод Электронно-микроскопическое изучение половых клеток эякулята позволяет оценить структурную целостность и, следовательно, функциональную адекватность субклеточных структур, ответственных за осуществление клеточного движения, пенетрирующей и оплодотворяющей способности сперматозоидов. Метод ультраструктурной диагностики патоспермии помогает выявить связь между нормальными показателями спермограммы и длительным, идиопатическим бесплодием. Только электронно-микроскопичекий анализ информативен у пациентов с астенозооспермией при "нормальных" результатах рутинных методов обследования (особенно при патологии аксонемы или митохондрий). У пациентов с аномалиями строения хроматина (незрелый хроматин) и акросомы ультраструктурный анализ может быть использован вместо/вместе с другими функциональными тестами. Проведение в этих случаях ультраструктурного анализа для исключения возможности генетически обусловленной патологии имеет прогностическое значение при выборе методов терапии или вспомогательной репродукции. Ультраструктурный анализ может быть использован в качестве функционального теста для прогнозирования исхода оплодотворения (особенно в случаях ЭКО). В лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН с конца 80-х годов отрабатывается схема клинико-медико-генетического обследования пациентов (детей разного возраста, женщин, мужчин) с нарушением репродуктивной функции [77, 78], включающая электронно-микроскопическое исследование (рис. 12).
Рис. 12. Место электронно-микроскопического анализа в обследовании пациентов с мужским бесплодием и нарушением сперматогенеза. Единственным ограничением для использования метода электронной микроскопии при функциональной диагностике качества сперматозоидов и причин недостаточности генеративной функции является недостаточная информированность врачей-клиницистов о таком диагностическом подходе [76]. Достоинством метода является возможность длительного (до 1 мес) хранения фиксированного материала, что позволяет различным андрологическим центрам пользоваться услугами специализированной лаборатории электронной микроскопии. Е.Е. Брагина, Р.А. Абдумаликов, Л.Ф. Курило, Л.В. Шилейко Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Минздрава РФ, Медико-генетический научный центр РАМН, Москва Литература 1. Oehninger S., Goddington C., Scott R. et. al. Hemizona assay: assassment of sperm disfunction and prediction of in vitro fertilisation outcome. Fertil Steril 1989; 51: 665-670. 2. Lanzendorf S., Oehninger S., Scott R.,Whitelock S., Hodgen G. Penetration of human spermatozoa through the zona pellucida of nonviable human oocytes. J Soc Gynecol Invest 1994; 1: 69-73. 3. Aitken R., Irvine D., Wu F. Prospective analysis of sperm-oocyte fusion and reactive oxygen species generation as criteria for the diagnosis of infertility. Am J Obstet Gynecol 1991; 164: 542-551. 4. Hoffman N., Hilscher B. Use of aniline blue to assess chromatin condensation in morphologically normal spermatozoa in normal and infertile men. Hum Reprod 1991; 6: 979-982. 5. Zamboni L. The ultrastructural pathology of the spermatozoon as a cause of infertility: the role of electron microscopy in the evaluation of semen quality. Fertil Steril 1987; 48: 711-734. 6. Mashiach R., Fish B., Eltes F., Tadir Y., Ovadia J., Bartoov B. The relationship between sperm ultrastructural features and fertilizing capacity in vitro. Fertil Steril 1992; 57: 1052-1057. 7. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge University press 1992. 8. Ludwig G., Frick J. Spermatology. Atlas and manual. Verlag Berlin Heidelberg, Springer- 1987. 9. Menkveld R., Oettle E., Kruger T., Swanson R., Acosta A., Oehninger S. Atlas of human sperm morphology. Maryland Williams and Wilkins Baltimore 1991. 10. Monesi V. Chromosome activities during meiosis and spermiogenesis. J Reprod Fertil (suppl.) 1971; 13: 1. 11. Bellve A. The molecular biology of mammalian spermatogenesis. In Oxford Reviews of Reproductive Biology.Ed. С.Finn, London. Oxf Univ Press 1979; 159-261. 12. Holstein A. Ultrastructural observations on the differentiation of spermatids in man. Andrologia 1976; 8: 157-163. 13. Saowaros D., Raniym F. The formation of disulfide bonds in human protamines during sperm maturation. Experientia 1979; 35: 131. 14. Fawcett D., Anderson W., Phillips D. Morphogenetic factors influensing the shape of sperm head. Dev Biol 1971; 26: 220-251. 15. Catewood Cook. Sequince-specific paking of DNA in human sperm chromatin. Science 1987; 236: 992-994. 16. Evenson D., Darzynkiewicz Z., Melamed M. Relation of mammalian sperm heterogeneity to fertility. Science 1980; 210: 1131-1133. 17. Abramsson L., Beckmen G., Duchek M., Nordenson I. Chromosomal aberrations and male infertility. J Urol 1982; 128: 52-57. 18. Vreeburg J., van Roijen J., Ooms M.P., van der Eijnden M., Weber R.F., Grootegoed J. Testis-specific histone 2B in human spermatosoa. Int J Androl 1997; 20: suppl 1: 92. 19. de Yebra L., Ballesca J., Vanrell J., Corzett M., Balhron R., Oliva R. Detection of P2 precusors in the sperm cells of infertile patients who have redused protamine 2 levels. Fertil Steril 1998; 69: 755-759. 20. Liu Y., Baker H. Sperm nuclear chromatin normality: relationship with sperm morphology, sperm-zona pellucida binding, and fertilization rates in vitro. Fertil Steril 1992; 58: 1178-1184. 21. Воробьева О.А., Филатов М.В., Леонтьева О.А., Семенова Е.В. Влияние аномальной организации хроматина сперматозоидов на развитие эмбрионов человека. Пробл репрод 1998; 1: 14-18. 22. Bianchi P., Manicardi G., Urner F., Campana A., Saccas D. Chromatin packaging and morphology in ejaculated human spermatozoa: evidence of hidden anomalies in normal spermatozoa. Mol Hum Reprod 1996; 2: 139-144. 23. Bowen R. On the acrosome of the animal sperm. Anat Rec 1924; 28: 1-13. Clermont Y., Tang X. Glycoprotein synthesis in the Golgi apparatus of spermadids during spermiogenesis of the rat. Anat Rec 1985; 213: 33-43. 24. Yanagimachi R. Mammalian fertilization. In: Knobil E., Neil J., eds. The Physiology of reproduction. 2nd edn. N.Y.: Raven Press 1994; 189-317. 25. Abdel-Halim A., Bailey J., Storey B., Blasco L., Heyner S. A comparison of three methods for detecting the acrosome reaction in human spermatozoa. Hum Reprоd 1996; 11: 741-745. 26. Tesarik J. Consensus workshop on advanced diagnostic andrology techniques. Acrosome reaction testing. Hum Reprod 1996; 11: 1467-1473. 27. Nistal M., Panagua R. Testicular and epididymal pathology. N.Y. 1984; 227. 28. Fuse H., Okumura M., Sakamoto M., Kasama T., Katayama T. Acrosome-reacted sperm in infertile and fertile men using triple-stain technique. Arch Androl 1993; 30: 41-45. 29. Holstein A., Roosen-Runge E. Atlas of Human spermatogenesis. Berlin Grosse Verlag, 1981; 1-224. 30. Tyler J., Broadle R., Stevens S. Round-headed spermatozoa: a case report. Pathology 1985; 17: 67. 31. El-Gothamy Z., El-Samahy M. Ultrastructure sperm defects in addicts. Fertil Steril 1992; 57: 699-702. 32. Курило Л.Ф., Дубинская В.П., Остроумова Т.В., Шилейко Л.В., Мхитаров В.А., Литвиненко В.М. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам. Пробл репрод 1995; 3: 33-38. 33. Курило Л.Ф., Любашевская И.А., Дубинская В.П., Гаева Г.Н. Кариологический анализ состава незрелых половых клеток эякулята. Урол и нефрол 1993; 2: 45-47. 34. Брагина Е.Е., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Дмитриев Г.А. Бесплодие при глобулоспермии и отсутствие акросомы сперматозоидов. Пробл репрод 1997; 3: 3: 53-55. 35. Bacetti B., Renieri T., Rosati F., Selmi M., Casanova S. Further observations on the morphogenesis of the round headed human spermatosoa. Andrologia 1977; 9: 255-264. 36. Singh G. Ultrastructural features of round-headed human spermatozoa. Int J Fertil 1992; 37: 99-102. 37. Pedersen H., Rebbe H. Fine structure of round-headed human spermatozoa. Reprod Fertil 1974; 37: 51-54. 38. Gilbert A., Thomas J., Cedars M., Davis N. Relationship between standart semen analysis parameters and oocyte fertilization. Int J Androl 1997; suppl 1: 48. 39. Carrell D., Emery B., Liu L. Characterisation of aneuploidy rates, protamine levels, ultrastructure, and functional ability of round-headed sperm from two siblings and implications for intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1999; 71: 511-516. 40. McKusick V. Mendelian Inheritance in man. 10th еd Baltimore: Johns Hopkins Univ Press 1992. 41. Florke-Gerloff S., Topfer-Petersson E., Muller-Esterl W., Mansouri S., Schatz R., Schirren S. Biochemical and genetic investigation of roundheaded spermatozoa in infertile men including two brithers and their father. Andrologia 1984; 16: 187-202. 42. Liu J., Nagy Z., Joris H., Tournaye H., Devroey P., Van Steirteghem A. Succesful fertilization and establishment of pregnancies after intracytoplasmatic sperm injection in patient with globozoospermia. Hum Reprod 1995; 10: 626-629. 43. In`t Veld P., Brandenburg H., Verhoeff A., Dhont M., Los F. Sex chromosomal abnormalities and intracytoplasmic sperm injection. Lancet 1995; 346: 773. 44. Gibbons I. Cilia and flagella of eukaotes. J Cell Biol 1981; 91: 107-113. 45. Fawcett D. The mammalian spermatozoon. Dev Biol 1975; 44: 394-436. 46. Breed W., Simerky C., Navara C., Vande Berg J., Schatten G. Distribution of microtubules in eggs and early embtyos of marsupial Monodelphis domestica. Dev Biol 1994; 164: 230-240. 47. Croset N. Behavior of the sperm centriole during sheep oocyte fertilization. Eur J Cell Biol 1990; 53: 321-332. 48. Nijs M., Vanderswalmen P., Vandamme B., Segal-Bertin G., Lejeune B., Segal L. et.al. Fertilizing ability of immotile spermatozoa after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1996; 11: 2180-2185. 49. Schatten H., Schatten G., Mazia D., Balezon R., Simerly C. Behavior of centrosomes during fertilization and cell division in mouse oocytes and sea urchin eggs. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 83: 105-109. 50. Paweletz N., Mazia D., Finze E. Fine structural studies of the bipolarisation of the mitotic apparatus in the unferilised sea urchin egg. 1. The structure and behavior of the centrosomes before the fusion of the pronuclei. Eur J Cell Biol 1987; 44: 195-204. 51. Paweletz N., Mazia D, Finze E. Fine structural studies of the bipolarisation of the mitotic apparatus in the unferilised sea urchin egg. 11. Bipolarisation before the first mitosis. Eur J Cell Biol 1987; 44: 205-213. 52. Sathananthan A., Ratnam S., Ng S., Tarin J., Gianaroli L., Trounson A. The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos. Hum Reprod 1996; 11: 345-356. 53. Sathananthan A. Functional cimpetence of abnormal spermatozoa. n Fishel S. (ed.) Baillie`re Clinical bstetrics and Gynaecology-Micromanipulation Techniques London: Ballie`re Tindall 1994; 141-156. 54. Strome S. Determination of cleavage planes. Cell 1993; 72: 3-6. 55. Fuller M., Hales K, Molina I., Hime G. Cellular mechanisms of spermatid differentiation. Mol Biol Cell 1993; 4: 30а. 56. Navara C., First N., Schatten G. Microtubule organization in the cow during fertilization, polyspermy, partenogenesis and nuclear transfer: the role of the sperm aster. Dev Biol 1994; 162: 29-40. 57. Kalousek D. Pathology of abortion: chromosomal and genetic correlation. In: Pathology of reproductive failure. Kraus F., Damjanov I., Kaufman N., eds. Baltimore:Willliams and Wilkins 1995. 58. Eliasson R., Mossberg B., Camner P., Afzelius B. The immotile cilia syndrome: a congenital ciliary abnormality as an etiologic factor in chronic airway infections and male sterility. N Engl J Med 1977; 297: 1. 59. Ryder T., Mobberley M., Hughes L., Hendry W. A survey of the ultrastructural defects associated with absent or impaired human sperm motility. Fertil Steril 1990; 53: 556-560. 60. Joannet P., Escalier D., Serres C., David G. Motility of human sperm without outer dinein arms. J Submicrosc Cytol Pathol 1983; 15: 67. 61. Sturgess J., Chao J., Turner J. Transposition of ciliary microtubules: another cause of impaired ciliary motility. N Engl J Med 1980; 6: 318. 62. Afzelius B., Eliasson R. Flagellar mutants in man: on the heterogeneity of the immotile cilia sindrome. J Ultrastruct Mol Struct Res 1979; 69: 43. 63. Hancock A., de Kretser D. The axonemal ultrastructure оf spermatozoa from men with asthenospermia. Fertil Steril 1992; 57: 661-664. 64. Kartagener M. Zur pathogeneses der bronchiektasien: bronchoiektasien bei situs viscerum inversus. Beitr Klin Tuberk 1933; 83: 489. 65. Bornman M., de Jager C., Erasmus L. et al. Kartagener`s syndrome with a difference: a case report. Hum Repr 1996; 11: 189. 66. Tasdemir I., Kahraman S., Tasdemir M. et al. Pregnancy after testicular sperm extraction and ICSI with totally immotile spermatozoa lacking dynein arms: a case report. Hum Reprod 1996; 11: 209. 67. Phillips D., Jow W., Goldstein M. Testis factors that may regulate gene expression: evidence from a patient with Kartagener` syndrome. J Androl 1995; 16: 158-162. 68. Samuel I. Kartagener's syndrome with normal spermatozoa. (Letter). J Am Med Ass 1987; 258: 1329-1330. 69. Patel-King R., Benashski S., Harrison A., King S. Chlamydomonas homologue of the putative murine t-complex distorter Tctex-2 is an outer arm dynein light chain. J Cell Biol 1997; 137: 1081-1090. 70. Fraser L., Dudley K. New insights into the T-complex and control of sperm function. J Bio Ass 1999; 21: 304-312. 71. Gopalkrishnan K. Use of negative staining technique and electron microscopy for the study of structural anomalies of outer dense fibres of human sperm flagellum. Int J Androl 1997; suppl 1: 33. 72. Брагина Е.Е., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Абдумаликов Р.М. Ультраструктурный и количественный кариологический анализ половых клеток из эякулята пациента с абсолютной азстенозооспермией. Пробл репрод 1997; 3: 4: 72-75. 73. Cooke H., Hargreave T., Elliott D. Understanding the genes involved in the spermatogenesis: a progress report. Fertil Steril 1998; 69: 989-995. 74. Nijs M., Vanderswalmen P., Vandamme B., Segal-Bertin G., Lejeune B., Segal L. et.al. Fertilizing ability of immotile spermatozoa after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1996;11: 2180-2185. 75. Wolf D., Feneux D., Escalier D., Rodrigues D., Frydman R., Jouannet P. Pregnancy after subzonal insemination with spermatozoa lacking dynein arms. J Reprod Fertil 1993; 97: 487-492. 76. Курило Л.Ф. Доля генетической патологии у пациентов с нарушением развития половой системы. В сб.: Сексопатология и андрология. Киев 1998; 4: 18-27. 77. Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Гришина Е.М. Структура наследственных нарушений репродуктивной системы. Вестн РАМН 2000; 5: 32-36. |
