Трансплантация кроветворных стволовых клеток и генотерапия плода: возможность клинического использования.
|
Пренатальная генотерапия с использованием ex-vivo трансдуцированных аутологичных кроветворных клеток или прямое введение гена in utero представляют собой другой потенциальный подход к лечению иммунокомпетентного плода-реципиента. Хотя показано, что такой подход осуществим в модельных системах животных, перед началом клинических испытаний из соображений безопасности необходимо провести доклинические эксперименты для оценки возможной трансдукции зародышевых клеток плода или материнских клеток.
Введение В течение последних 25 лет достигнуты большие успехи в пренатальной диагностике врожденных заболеваний с использованием как инвазивных, так и неинвазивных методов (Holzgreve, 1997). В настоящее время большинство заболеваний лимфатико-кроветворной системы может быть диагностировано в I триместре беременности. В ближайшем будущем список заболеваний, которые могут быть диагностированы пренатально, неизбежно расширится благодаря введению неинвазивного скрининга населения, а также благодаря развитию молекулярных методов, включая технологию ДНК-микрочипов. Вслед за этим возрастет потребность в различных методах лечения. При некоторых из этих заболеваний возможна постнатальная терапия посредством трансплантации кроветворных стволовых клеток (КСК), полученных из костного мозга или пуповинной крови. Однако возможности такой терапии часто ограничены отсутствием гистосовместимого донора, тяжелыми осложнениями, связанными с лечением, и поражением органов, развившимся во время беременности. Пренатальная трансплантация КСК потенциально позволяет избежать этой проблемы и сделать возможным успешное лечение генетических заболеваний, включая гематологические, иммунологические и метаболические нарушения. В последнее время достигнуты клинические успехи в пренатальной трансплантации КСК человеку, однако до настоящего времени они ограничены заболеваниями, сопровождающимися тяжелым иммунодефицитом плода. В процессе разработки ряд методов, призванных преодолеть неэффективность приживления трансплантированных клеток в организме имммунокомпетентного хозяина. Кроме того, последние достижения в области направленного введения генов открывают новые перспективы генотерапии in utero, являющейся альтернативой трансплантации аллогенных стволовых клеток. Однако попытки генотерапии плода человека пока не предпринимаются. Трансплантация кроветворных клеток in utero Преимущества внутриматочной терапии С помощью постнатальной трансплантации стволовых клеток, полученных из костного мозга или пуповинной крови, потенциально возможно излечить ряд генетических патологий, включая гемоглобинопатии, иммунодефицитные заболевания (и заболевания накопления) (Lucarelli и соавт., 1990, 1999; Issaragrisil и соавт., 1995; Krivit и соавт., 1998; Buckley и соавт., 1999). Несмотря на обнадеживающие результаты, достигнутые с помощью трансплантации аллогенных стволовых клеток при ряде заболеваний, некоторые препятствия по-прежнему существуют. Только для трети пациентов можно найти донора, совместимого по главному комплексу гистосовместимости (ГКГС) человека. Необходимость иммуносупрессии и отторжения костного мозга реципиента приводит к заболеваемости, связанной с лечением. Развитие реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) и неэффективность трансплантата особенно часто наблюдаются при трансплантации стволовых клеток неродственного донора. Кроме того, заболевание может привести к необратимому внутриутробному поражению плода (например, болезни накопления или a-талассемии), в результате которых токсичность, связанная с процедурой трансплантации, еще больше возрастет. Наконец, постнатальная трансплантация стволовых клеток - чрезвычайно дорогостоящая процедура. Учитывая особенности физиологии онтогенетического развития кроветворной и иммунной системы плода человека, эти проблемы теоретически возможно обойти с помощью пренатальной трансплантации стволовых клеток (Zanjani и соавт., 1997). Имеются убедительные доказательства того, что на ранних сроках беременности, до окончания I триместра, плод не является иммунокомпетентным (Stites и соавт., 1974; Rayfield и соавт., 1980; Thilaganathan и соавт., 1992, 1993a) до тех пор, пока тимус плода не начнет контролировать определение антигена, распознавая его как собственный или чужеродный в процессе положительного или отрицательного отбора, представляющего собой делецию клона или его размножение (Blackman и соавт., 1990). Таким образом, при достаточно ранней трансплантации чужеродные клетки будут распознаны как "свои", и отторжения не произойдет, что позволит обойти необходимость иммуносупрессии реципиента и подбора трансплантируемых клеток, совместимых по ГКГС. Теоретически возможна индукция долгосрочной толерантности, специфичной для данного донора. Эволюционный онтогенез кроветворной системы характеризуется хронологической последовательностью изменений, происходящих в первичном центре кроветворения, начиная с желточного мешка и области мезонефроса у эмбриона и кончая печенью плода и, наконец, костным мозгом (Tavassoli, 1991; Medvinsky, Dzierzak, 1996; Tavian и соавт., 1996). До начала II триместра беременности и во время него костный мозг по-прежнему остается относительно незаполненным, тогда как ниши для кроветворных клеток быстро увеличиваются в объеме, что дает возможность размножения популяции донорских клеток костного мозга без предварительной абляции костного мозга реципиента перед трансплантацией. В соответствии с изложенным, на ранних сроках беременности можно использовать "окно" в развитии эмбриона для трансплантации КСК, не подбирая донора, совместимого по ГКГС, и не прибегая к абляции костного мозга (Blau and Stamatoyannopoulos, 1996). В случае успеха можно будет предотвратить развивающееся поражение органа и необратимое заболевание. Кроме того, удастся воспользоваться и специфическими преимуществами пренатальной трансплантации костного мозга перед постнатальной: менее выраженными повреждениями, обусловленными РТПХ, и более быстрым восстановлением иммунитета (Blazar и соавт., 1998). Итак, все заболевания, которые можно вылечить посредством постнатальной трансплантации костного мозга и которые могут быть диагностированы пренатально (включая гематологические иммунологические и метаболические нарушения), потенциально подлежат лечению посредством внутриутробной трансплантации КСК (Surbek и соавт., 1999). Данные, полученные в экспериментах на животных Идея о пренатальной индукции химеризма возникла в результате наблюдения за двуплодными беременностями. Естественный химеризм у двуяйцовых близнецов с общим трансплацентарным кровообращением описан для крупного рогатого скота (Owen, 1945), приматов (Picus и соавт., 1985) и человека (Van Djik и соавт., 1996). На основании представления о приобретенной неонатальной толерантности к чужеродным антигенам (Billingham и соавт, 1953) были проведены первые испытания в модельной системе мыши, которые показали, что интраплацентарная инъекция кроветворных стволовых клеток позволяет пренатально излечивать генетические анемии (Fleischmann, Mintz, 1979). Позднее была описана модельная система овцы, в которой удалось успешно инъецировать клетки фетальной печени в брюшную полость другого плода (Flake и соавт., 1986). Впоследствии было разработано несколько различных модельных систем животных, в том числе мыши (Blazar и соавт., 1995; Archer и соавт., 1997) и обезьяны (Harrison и соавт., 1989; Cowan и соавт., 1996). Эти исследования на животных показали, что за исключением овцы (Zanjani и соавт., 1992; Colas и соавт., 1999) и иммунодефицитных мышей [например, мышей, больных диабетом без ожирения и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (Archer и соавт., 1997)], уровень приживления при рождении или вскоре после него составляет <1%. Более того, в модельной системе овцы с цероид-липофусцинозом после внутриматочной трансплантации аллогенных фетальных клеток печени не отмечалось никакого благотворного влияния на клинические и гистологические параметры центральной нервной системы, связанные с заболеванием, несмотря на средний уровень приживления донорских клеток, равный 9% (Westlake и соавт., 1995). В недавно проведенном исследовании были изучены механизм и кинетика приживления после внутриматочной трансплантации, проведенной с целью определения специфических барьеров, препятствующих приживлению, и возможных усовершенствований, которые могут приживлению способствовать (Shaan и соавт., 1999). Исследования на животных продемонстрировали принципиальное ограничение метода внутриматочной трансплантации стволовых клеток, а именно низкий уровень приживления, препятствующий клинической эффективности при большинстве заболеваний. Тем не менее многие из этих моделей оказались полезными для изучения механизмов и кинетики приживления трансплантированных клеток костного мозга, эффекта внесенной дозы донорских клеток и манипуляций с трансплантатом. Клинические данные В настоящее время опубликованы данные более чем о 30 случаях внутриматочной трансплантации КСК, треть из которых была выполнена по поводу тяжелого комбинированного иммунодефицита или хронического гранулематоза (Flake, Zanjani, 1999). В других случаях клетки были трансплантированы плодам с резус-изоиммунизацией, гемоглобинопатиями (главным образом a- и b-талассемиями) или болезнями накопления (синдромом Херлера, болезнью Краббе). Были использованы различные источники донорских стволовых клеток (клетки костного мозга отца, матери, братьев или сестер или фетальные клетки печени) как при элиминации Т-клеток /обогащении CD34+-клетками, так и без этих процедур. Гестационный возраст реципиентов варьировал от 11 до >30 нед, и в некоторых случаях использовались множественные трансплантаты. У плодов с тяжелой недостаточностью иммунной системы был достигнут значительный уровень приживления. Недавно опубликованы сообщения об успешном лечении плодов с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, сцепленным с Х-хромосомой; в обоих случаях после рождения отмечался устойчивый мозаичный химеризм (донорские Т-клетки и естественные клетки-киллеры - NK-клетки и В-клетки хозяина) (Flake и соавт., 1996; Wengler и соавт., 1996). В противоположность этим данным, при отсутствии у плода клинически значимого иммунодефицита, стабильного приживления трансплантата достичь не удавалось, хотя в некоторых случаях был показан микрохимеризм и донорспецифичная толерантность (Thilaganathan и соавт., 1993b). Таким образом, стабильного приживления у иммунокомпетентного плода-хозяина с сохраненным костным мозгом до сих пор достичь не удается. Это может объясняться либо отсутствием конкурентного преимущества донорских клеток по сравнении с кроветворными клетками хозяина при заполнении ниш костного мозга либо отторжением трансплантата. Подходы к преодолению неэффективности трансплантата В основу применяемых в настоящее время методов, направленных на улучшение приживления донорских клеток, положены более точные представления о биологии внутриматочной трансплантации, полученные в экспериментах на животных и в клинической практике. К ним относятся: выбор времени для трансплантации Это очень важный вопрос для плодов, не страдающих иммунодефицитом. "Окно транспланта ции" весьма непродолжительно - считают, что стадия беременности, на которой плод иммунологически некомпетентен (и неспособен распознавать и отторгать чужеродные антигены), завершается на 14 нед беременности; источник КСК Согласно некоторым данным, стволовые клетки фетальной печени могут быть более предпочтительными, чем клетки, полученные из организма взрослого человека, например, костного мозга или периферической крови, особенно в случае внутриматочного лечения гемоглобинопатий (например, талассемии), хотя эти предположения не подтверждены клинической практикой (Westgren и соавт., 1996). Однако использование печени плода или клеток костного мозга абортированных плодов имеет серьезные недостатки, а именно: этические соображения, риск инфицирования реципиента и ограниченное число клеток, которые можно получить у одного донора. Пуповинная кровь - еще один важный источник фетальных клеток, которые обладают подходящими характеристиками и могут быть использованы в качестве внутриматочных трансплантатов (Surbek и соавт., 1998); доза донорских клеток В модельной системе плода овцы имеет место дозозависимое повышение уровня приживления, который после достижения определенной дозы, вероятно, выходит на плато (Zanjani и соавт., 1997). Однако результаты экспериментов по постнатальной трансплантации, проведенные на мышах, свидетельствуют о том, что назначение больших доз донорских клеток может быть полезным, поскольку они способны даже вытеснять клетки организма-хозяина из ниш в костном мозге, обеспечивая в целом конкурентное преимущество (Bachar-Lustig и соавт., 1995; Reisner, Martelli, 1999, 2000). При повторных трансплантациях в организм человека c интервалом 1-2 нед (Flake и соавт., 1996) были получены дополнительные подтверждения хоминга и пролиферации донорских кроветворных клеток в микроокружении стромы хозяина; способ назначения Точно неизвестно, действительно ли концентрации донорских клеток в кроветворном микроокружении органа мишени (в печени и костном мозге плода) после внутривенной инъекции оказываются выше, чем после внутриперитонеальной (Westgren и соавт., 1996). Однако даже если внутрисосудистый путь более благоприятный, он может быть технически более сложным и рискованным при гестационном сроке <14 нед (Surbek и соавт., 2000), поэтому большинство исследователей предпочтут внутриперитонеальные инъекции. Тем не менее неизвестно, в какой мере трансплантированные клетки проникают в циркулирующую кровь и достигают органов-мишеней; модификация трансплантата посредством котрансплантации донорспецифичных стромальных клеток и/или факторов роста Данная стратегия основана на предположении, согласно которому взаимодействие кроветворных и стромальных клеток, необходимое как для хоминга, так и для пролиферации и экспрессии кроветворных клеток, ограничено, если клетки не являются гистосовместимыми. В соответствии с этим предположением, котрансплантированные стромальные клетки того же донора служат дополнительной поддержкой кроветворным клеткам. В настоящее время как в аллогенной, так и в ксеногенной модельной фетальной системе овцы подтверждено, что котрансплантация стромы приводит к устойчивому усилению приживления донорских клеток и повышению уровня циркулирующих донорских клеток у реципиента (Almeida-Porada и соавт., 1999, 2000). Раннее присутствие донорских клеток в периферической крови особенно полезно при заболеваниях, которые могут привести к раннему поражению органов плода. Назначение фактора роста во время внутриматочной трансплантации или после нее может послужить дополнительной поддержкой донорских клеток (Tarantal, Cowan, 1999), однако до сих пор не показано, повышается ли при использовании такого подхода уровень долгосрочного приживления. Тем не менее факторы роста можно назначать пренатально или постнатально, чтобы стимулировать выход донорских клеток на периферию (Carrier и соавт., 1997); мероприятия по подготовке плода Цель подготовки плода заключается в том, чтобы обеспечить селективное преимущество донорских клеток посредством подавления взаимодействия кроветворных и стромальных клеток хозяина и "минимальной" абляции гемопоэза в организме хозяина перед трансплантацией. Согласно экспериментальным данным, добавление специфических блокирующих антител для поддержки приживления донорских клеток может быть одним из способов улучшения конкурентоспособности этих клеток (Zanjani и соавт., 1999). В число методов, успешно используемых для улучшения приживления, входит использование иммунодепрессантов (например, глюкокортикоидов или циклоспорина), низкодозные схемы лечения цитотоксичными препаратами или облучение. Однако одно из важных потенциальных преимуществ внутриматочной трансплантации заключается в том, что она позволяет избежать подготовки реципиента, обычно проводимой при постнатальной трансплантации стволовых клеток. Проведение подготовки означало бы потерю этого преимущества, а токсические или тератогенные побочные эффекты этих агентов могли бы стать причиной запрета на их назначение быстро развивающемуся плоду, особенно во время I триместра. Необходимы новые стратегии, например, назначение аттенуированного парвовируса В19, который, как известно, подавляет костный мозг плода с последующим развитием тяжелой анемии (Shields и соавт., 2000); микрохимеризм, индукция толерантности и постнатальная бустер-трансплантация Недавно гемопоэтический химеризм идентифицирован у реципиентов трансплантатов сулидных органов, где он, предположительно, необходим для поддержания иммунологической толерантности к донорским органам. В настоящее время концепция микрохимеризма и индукции толерантности исследуется в клинических условиях посредством одновременной трансплантации клеток, полученных из костного мозга, и трансплантации сулидных органов того же донора с целью индукции донорспецифичной толерантности (Elwood и соавт., 1998). Устойчивый микрохимеризм после внутриматочной трансплантации стволовых клеток был достигнут в ряде модельных систем животных, а также у человека (Thilaganathan и соавт., 1993b). Донорспецифичная толерантность показана in vitro для человека и in vivo для мыши (Carrier и соавт., 1995) и приматов (Mychaliska и соавт., 1997) при использовании трансплантата почки того же донора. Согласно данным других доклинических исследований, толерантность, индуцированная в период пренатального развития, может быть использована для постнатальной бустер-трансплан тации стволовых клеток того же донора при наличии минимальной подготовки плода или в ее отсутствие (Milner и соавт., 1999). Генотерапия Генотерапия - еще одна стратегия, позволяющая обойти ограничения при пренатальной трансплантации аллогенных стволовых клеток. Генотерапия, направленная на КСК КСК являются привлекательным объектом для генотерапии соматических клеток, поскольку они способны на протяжении всей жизни продуцировать потомство клеток, содержащих "терапевтический" ген. В основу применяемых в настоящее время клинических протоколов постнатальной терапии детей с генетическими заболеваниями положена ex-vivo ретровирусная трансдукция лимфоцитов (Bordignon и соавт., 1995) или кроветворных стволовых клеток/клеток-предшественников, полученных из костного мозга или пуповинной крови, с последующей аутотрансплантацией реконструированных клеток обратно в организм пациента (Kohn и соавт., 1995). Первоначальные испытания показали выполнимость и безопасность генотерапии с использованием клеток из пуповинной крови при назначении ее пациентам с аденозин-дезаминазной недостаточностью, хотя клиническая эффективность этой процедуры, по данным изучения отдаленных результатов, была крайне ограниченной (Kohn и соавт., 1998). Однако недавно появилось сообщение о клинически успешной генотерапии (согласно оценке, выполненной через 10 мес после процедуры) при тяжелом комбинированном иммунодефиците, сцепленном с Х-хромосомой, которая была проведена при использовании аутологичных клеток CD34+ костного мозга, трансдуцированных ретровирусом (Cavazzana-Calvo и соавт., 2000). Тем не менее, прежде чем генотерапия найдет широкое клиническое применение, необходимо преодолеть несколько препятствий (Blau, Khavari, 1997). Основные препятствия связаны с эффективностью трансдукции; случайной интеграцией генно-инженерной конструкции "генный вектор" в геном хозяина; продолжительностью экспрессии "терапевтического" гена ("молчание гена"); иммунным ответом хозяина, направленным против вектора, гена или генного продукта; воспроизводимой продукцией безопасных, насыщенных, беспрепятственно реплицируемых (replication-free?) векторов (Verma, Somia, 1997). Экспрессия генов может сильно нарушиться в результате спонтанного прекращения активности регуляторной последовательности, контролирующей экспрессию гена; в результате инактивации промоторов (например, после метилирования) в трансдуцированной клетке-хозяине; под воздействием специфичных защитных механизмов хозяина или устранения трансдуцированных клеток иммунной системой хозяина после распознавания ею чужеродного генного продукта (Bestor, 2000). Показано, что воспалительные цитокины (например, фактор некроза опухоли - a-ФНО или g-интерферон) задействованы в иммунном ответе хозяина, направленном против "чужеродного" гена или генного продукта, и непосредственно подавляют экспрессию трансгенов (Qin и соавт., 1997). Хотя в модельной системе мыши удалось достичь некоторого успеха (Bunting и соавт., 1998), последние результаты, полученные в больших модельных системах животных, показали, что несмотря на успешное приживление генетически модифицированных аутологичных кроветворных клеток-предшественников/стволовых клеток, экспрессия гена in vivo может все-таки быть сильно нарушена (Lutzko и соавт., 1999). Дополнительные трудности связаны с идентификацией мишени для переноса гена, т.е. КСК, поскольку характерные отличительные маркеры недифференцированных КСК, находящихся в состоянии покоя, до сих пор отсутствуют. Согласно последним сообщениям, для стволовых клеток не существует единого маркера, с вытекающим отсюда выводом о гетерогенности компартмента стволовых клеток (Goodell и соавт., 1997; Bhatia и соавт., 1998; Ziegler и соавт., 1999). Системы переноса генов в КСК включают ретровирусные и аденовирусные векторы, аденоассоциированные векторы, лентивирусные векторы (в основу которых положен геном ВИЧ) и векторы невирусной природы (липосомные) (см. обзор по данному вопросу Verma, Somia, 1997). Недавно опубликовано сообщение о новом поколении аденоассоциированных вирусных векторов, которые после внутримышечной (Herzog и соавт., 1999) или внутрипеченочной (Snyder и соавт., 1999) инъекции обеспечивали успешную длительную экспрессию гена и устранение гемофилии в модельных системах собаки и мыши. Ретровирусы (в отличие от аденовирусов) способны стабильно встраиваться в геном хозяина, если клетки хозяина активно делятся, поэтому при выборе вектора для доставки гена в КСК им отдается предпочтение. Однако существует важная проблема, заключающаяся в неэффективности ретровирусного переноса генов в неделящиеся клетки, например, в КСК (Brenner, 1996). Эту проблему не удается решить до конца с помощью новых стратегий эффективной и устойчивой ретровирусной трансдукции, а именно: с помощью предварительной стимуляции ранее не использовавшимися факторами роста, например, тромбопоэтином (фактором роста и развития мегакариоцитов) и лигандом At3; с помощью центрифугирования или трансдукции на фрагментах фибронектина (Van Hennik и соавт., 1998). Недавно разработаны лентивирусные векторные системы на основе ВИЧ с репликационной недостаточностью, которые стабильно интегрируются в геном хозяйских клеток как делящихся, так и неделящихся (Miyoshi и соавт., 1999), в том числе в геном КСК плода (Luther-Wyrsch и соавт., 1999). На них возлагаются большие надежды как на векторы, с помощью которых удастся осуществить длительную, стабильную трансдукцию КСК и их потомства. Генотерапия плода: опыт, полученный в модельных системах животных Развивающаяся кроветворная система плода характеризуется несколькими особенностями, которые могут оказаться полезными для переноса генов и благодаря которым эта система высокочувствительна к генной трансдукции (Coutelle и соавт., 1995). К этим особенностям относятся высокий пролиферативный статус и экспансия пула стволовых клеток, относительно небольшое количество необходимых генно-инженерных стволовых клеток и предполагаемое отсутствие иммунного ответа, направленного на вектор, после переноса гена в предварительно сенсибилизированный плод, что позволяет избежать прерывания экспрессии гена и/или повреждения тканей (Zanjani, Anderson, 1999). Кроме того, недавно показано, что стволовые клетки из пуповинной крови плода обладают высоким потенциалом экспансии (Wyrsch и соавт., 1999) и более выраженным потенциалом ретровирусной трансдукции по сравнению с клетками взрослого организма (Ektherac и соавт., 1990; Luther-Wyrsch и соавт., 1999). Более того, последние данные, полученные в экспериментах по трансплантации стволовых клеток в бластоцисту мыши, показали, что экспрессия гена в донорских клетках в значительной степени зависит от стадии развития микроокружения хозяина (Geiger и соавт., 1998). Это может означать, что после пренатального генного переноса экспрессия гена оказывается выше, чем после постнатальной генотерапии. Разработаны различные модели внутриутробного переноса генов в различные клетки и органы, включая эпителиальные клетки легких (Holzinger и соавт., 1995; Sekhon, Larson, 1995; Vincent и соавт., Larsen и соавт., 1997), гепатоциты (Wang и соавт., 1998), клетки кожи (Hayashi и соавт., 1996), кишечника (Wu и соавт., 1999), сердца (Woo и соавт., 1997) и артериального протока (Mason и соавт., 1999). В модельных системах были использованы интраамниотический, интратрахеальный, интраперитонеальный, интрапеченочный, интрасосудистый, интраплацентарный или in situ способы назначения генно-инженерной конструкции "вектор-ген". Показано, что возможен также трансплацентарный перенос конструкции "вектор-ген" после ее инъекции в кровообращение материнского организма (Tsukamoto и соавт., 1995). Однако такой, вероятно, не подходит для человека из-за высокого риска трансдукции материнского организма. Альтернативный подход заключается в направленной доставке вектора в плацентарную ткань, а не в кроветворные клетки. В небольшой модельной системе животных аутологичные клетки трофобласта из плаценты грызуна были выделены, генетически изменены in vitro и выжили после ретрансплантации в плаценту in utero, с последующей экспрессией генного продукта, который был обнаружен в циркулирующей крови плода (Senut и соавт., 1998). В настоящее время ведется изучение двух различных стратегий переноса генов в кроветворные клетки плода: генотерапия ex-vivo Данная стратегия предусматривает аутологич ную трансплантацию трансдуцированных in vitro стволовых клеток, которая уже осуществляется с некоторым успехом для лечения новорожденных детей с аденозин-дезаминазной недостаточностью при использовании стволовых клеток из пуповинной крови (Kohn и соавт., 1998) или при использовании в более поздние сроки аутологичного костного мозга (Cavazzana-Calvo и соавт., 2000). В экспериментах на животных показана осуществимость генотерапии ex-vivo с использованием циркулирующих КСК, полученных из циркулирующей крови плода при пункции пуповины и вновь трансплантированных плоду после размножения и трансдукции ex vivo (Kantoff и соавт., 1989; Lutzko и соавт., 1999b; Omori и соавт., 1999; Winkler и соавт., 1999). Основное преимущество этого метода заключается в значительно более низком риске трансдукции зародышевой линии по сравнению с переносом гена in vivo, при котором весь плод подвергается прямому воздействию насыщенной генно-инженерной конструкции "вектор-ген". С другой стороны, серьезные технические проблемы, связанные с получением достаточного количества стволовых клеток плода во время беременности, по-прежнему существуют и ожидают решения; генотерапия in vivo При использовании данного подхода генсодержащий вектор (вместе с клетками-продуцентами или без них) переносят непосредственно в организм плода, что приводит к трансдукции in vivo КСК плода. Недавно опубликованы сообщения об успешной и длительной экспрессии гена в модельной системе овцы после интраперитонеального переноса гена в кроветворные клетки (Porada и соавт., 1998; Tran и соавт., 2000); а также о том, что внутриматочное введение генного вектора оказалось осуществимым и эффективным в различных модельных системах животных (Вaumgartner и соавт., 1999; Lipshutz и соавт., 1999; Schactner и соавт., 1999; Themis и соавт., 1999). Хотя этот подход технически проще, следует ожидать более высокого риска, связанного с трансдукцией зародышевой линии; вопросы безопасности, связанные с пренатальным переносом гена Во всех случаях, когда в терапевтических целях осуществляют перенос гена, большое значение имеют вопросы безопасности (Billings, 1999; King и соавт., 1999). Серьезные опасения связаны с риском трансдукции гонадных клеток, которая может привести к генетической трансдукции зародышевой линии. Существует также потенциальный риск для матери, поскольку теоретически возможна трансдукция ее соматических или половых клеток в результате трансплацентарной миграции генно-инженерной конструкции "вектор-ген". Другой важный аспект безопасности связан с возможностью инсерционного мутагенеза в клетках плода, в результате которого может возникнуть функциональный дефект гена, приводящий к "генетическому" заболеванию или образованию злокачественной опухоли. Как уже упоминалось выше, с точки зрения этих рисков, генотерапия ex-vivo должна быть более безопасной по сравнению с внутриматочным введением генного вектора in vivo. Однако при проведении генотерапии плода эти возможные осложнения полностью исключить никогда не удастся. В настоящее время проводятся исследования по определению риска трансдукции зародышевых клеток и клеток материнского организма; согласно некоторым результатам, этот риск крайне низок (Ye и соавт., 1998; Tran и соавт., 2000). Однако для определения точной величины этого риска (который может зависеть от используемых векторных систем, возраста плода-реципиента, способа назначения вектора, титра вирусных частиц с репликационной недостаточностью и клеток-мишеней) потребуется провести эксперименты на большом числе животных. Выводы Пренатальная трансплантация КСК представляет собой перспективный подход к лечению различных тяжелых врожденных заболеваний. Хотя на преиммунной стадии развития плод теоретически восприимчив к трансплантации стволовых клеток, до настоящего времени эти надежды частично оправдались лишь в отношении плодов с иммунологическими заболеваниями. Для успешного лечения других заболеваний необходимо лучше представлять физиологию иммунологического развития плода и его нарушения, специфичные для конкретной болезни, а также молекулярный механизм взаимодействия стволовых клеток и их микроокружения в процессе кроветворного хоминга в костном мозге плода после трансплантации КСК. Хотя генотерапия плода может оказаться единственным способом успешного пренатального лечения некоторых из этих заболеваний, предстоит преодолеть серьезные препятствия общего характера, главным образом, связанные с эффективной трансдукцией КСК и длительной экспрессией гена. Кроме того, необходимо исключить теоретически возможную трансдукцию зародышевых клеток или материнских клеток. Прежде чем генотерапия плода может быть использована для лечения человека, необходимо решить эти вопросы, а также рассмотреть важнейшие этические стороны, связанные с ближайшими и отдаленными последствиями (Fletcher, Richter, 1996; Schneider, Coutelle, 1999; Caplan, Wilson, 2000), руководствуясь лозунгом "Действуйте с осторожностью!". Статья подготовлена к печати М.В. Корякиным (Центр Репродукции МЗ РФ) Перевод с англ. М.В. Корякина * Human Reproduction Update 2001;7:1:85-91 Новый метод хирургического лечения недержания мочи при напряжении (TVT) В клинике урологии МГМСУ (на базе 50-й Городской клинической больницы) метод TVT применяется почти 3 года, выполнено более 250 операций. Полный эффект достигнут у 92%, эффекта не было у 5% больных. Свободная петля из пролена проводится из влагалища в надлобковую область через небольшие разрезы. Эффект удержания мочи обеспечивается поддержкой уретры петлей из пролена. Метод минимальноинвазивный, операция длится около 30 минут, выполняется под местным обезболиванием и позволяет выписать больную из стационара в кратчайшие сроки. Тел.: (095)109 4482 |