Оценка морфологии сперматозоидов согласно строгим критериям (обзор литературы).

Исследование эякулята является "краеугольным камнем" обследования бесплодной пары. Несмотря на попытки улучшения (стандартизации) анализа, предпринимаемые ВОЗ (1980, 1987, 1992, 1999), субъективная в целом оценка параметров эякулята является источником ошибок и значительной вариабельности получаемых результатов [1]. Клинические суждения, сделанные на основе интерпретации одного или более анализов эякулята, зачастую некорректны и несравнимы между различными центрами. Не существует ни одного теста, который бы предсказывал с высокой точностью оплодотворяющий потенциал эякулята in vivo или in vitro, за исключением случаев глубоких нарушений, в частности азооспермии. Внедрение интрацитоплазматической инъекции сперматозои да (ИКСИ) явилось прорывом в лечении тяжелого мужского бесплодия, поскольку процедура ИКСИ позволяет достигать стабильной частоты оплодотво рения между 50 и 70%, даже при значительном нарушении оплодотворяющей способности спермы. Это требует диагностики таких тяжелых случаев с прогнозом достоверно низких шансов на оплодотворение при проведении стандартного ЭКО. Развитие вспомогательных репродуктивных технологий привело к созданию ряда функциональных тестов (индукция акросомальной реакции, тест пенетрации ооцита хомячка, связывание с зоной пеллюцида и др.). Несмотря на свою научную ценность, большинство этих тестов не применимы в рутинной работе сперматологической лаборатории в силу их дороговиз ны, необходимости обученного персонала и специального оборудования. Исследование морфологии является, вероятно, наилучшим для прогноза оплодотворяющей способности спермы. В 1986 г. Kruger и Menkveld предложили строгие критерии, основанные на морфологии посткоиталь ных сперматозоидов. Текущие данные свидетельству ют, что исследование спермальной морфологии, выполненное согласно строгим критериям, способно предсказывать исходы оплодотворения in vitro и частоту наступления беременности с точностью, большей, чем другие традиционные параметры эякулята, а также другие методы оценки морфологии [2—4, 9, 12]. Этапы изучения спермальной морфологии Характерной особенностью нормального (фертильного) эякулята человека является многообразие морфологических типов сперматозоидов. Различия могут быть связаны не только с размерами и формой головки, акросомы, но также со степенью вакуолизации ядра, размером цитоплазматических капель, нарушениями средней части и хвоста. Первое описание человеческих сперматозоидов было сделано van Leeuwenhoek в 1677 г. В письме Лондонскому королевскому обществу он описал их как "живых, микроскопиче ских животных... …иногда более тысячи в образце, размером с песчинки". В дальнейшем достаточно мало внимания уделялось изучению морфологии сперматозоидов, до тех пор, пока Cary (1916) не систематизи ровал имеющиеся данные литературы и не сделал вывод о связи между увеличением доли патологиче ских сперматозоидов (тератозооспермией) и снижением мужской фертильности. Williams и Savage (1925) были первыми, придавшими большое значение измерению размеров головки сперматозоида для репродуктивного потенциала, позднее подтвержденное Moench и Holt (1931). Описание акросом впервые было дано Williams (1934), он же выделил в сперматозоиде четыре части — головку, шейку, среднюю часть и хвост. Williams предложил шесть морфологических классов, а также подчеркнул значение использования стандартного подхода при повторных оценках. Moench (1940) указал на важную роль других клеток, таких как лейкоциты, герминальный эпителий. MacLeod (1951) ввел первую классификационную систему, в которой сперматозоиды были разделены на шесть различных групп на основании размеров и формы головки. Freund (1966) предложил классифицировать сперматозоиды по головкам на шесть классов, а также учитывать дефекты хвоста и незрелые клетки. Он придал особую важность стандартизации анализа. Так, в одном из его исследований 47 участников оценивали по микрофотографиям 500 сперматозоидов. Это исследование выявило хаотическую ситуацию, поскольку было дано столько различных толкований "нормальности", сколько участников было вовлечено. Не было единого подхода ни к приготовлению препарата, ни к использованию увеличения, ни к количеству подсчитывае мых сперматозоидов. Eliasson (1971) отвергал подсчет только одного дефекта и рекомендовал оценивать весь сперматозоид; его принцип — подсчитывать все дефекты (головки, хвоста, шейки, средней части) и выражать как процент к общему числу сперматозои дов. Он также первым предложил проводить измерения размеров сперматозоидов в процессе анализа. Предложенный им критерий оценки "нормальности" (пороговая точка) составлял 40% и более. David (1975) описал целую новую концепцию оценки морфологии, которая заключалась во взаимосвязи всех нарушений и их комбинаций. Главный недостаток этой системы состоял в ее сложности. Классификации ВОЗ (1980, 1987) стали вехами в истории изучения спермальной морфологии, хотя были далеко не исчерпывающими. В те годы морфология не относилась к числу ценных параметров. Классификация ВОЗ (1980) была основана на системе MacLeod, к которой были добавлены четыре класса нарушений (грушевидные головки, дефекты средней части, цитоплазматические капли и дефекты хвоста), что составило в общем 10 классов. Главным недостатком этой системы была идея, что только одно нарушение на сперматозоид должно приниматься в счет, таким образом отвергался принцип Eliasson, согласно которому должен оцениваться весь сперматозоид. Уже во втором руководстве ВОЗ (1987) было внесено изменение, заключающееся во множественной оценке. Были добавлены два новых класса (круглые и булавовидные головки) и исключены три дефекта (цитоплазматические капли, дефекты хвоста и средней части). Было описано в результате 9 классов головок сперматозоидов; введены две другие категории средней части (нормальная, ненормальная, цитоплазматические капли) и хвоста (нормальный, ненормальный). Пороговая точка составляла 50% и более. Hofmann (1985) доложил о другой системе для оценки морфологии сперматозоидов, так называемой дюссельдорфской классификации. Согласно этой системе, на первый план выходят связи между нарушениями морфологии и клиническими нарушениями. Позднее, Крюгером и Менквельдом (1986—1990) были предложены так называемые "строгие тайгербергские критерии", основанные на морфологии "посткоиталь ных" сперматозоидов, т.е. сперматозоидов, выявляемых на уровне внутреннего зева матки. На этом уровне популяция сперматозоидов является однородной и морфологически не сравнимой со сперматозоидами на уровне наружного зева матки. Как было доложено ранее D. Mortimer и соавт. (1982), B. Fredricsson и R. Bjork (1977), мигрировать через цервикальную слизь способны только определенные морфологические типы сперматозоидов [5, 6]. Эта природная селекция приводит к тому, что возникает популяция сперматозои дов со значительно более высокими морфологически ми характеристиками, чем первичный образец эякулята. Было предложено, что эти "идеальные" сперматозоиды являются более фертильными, чем имеющие морфологические дефекты. Идея использовать этот тип сперматозоидов в качестве эталона для сравнения лежит в основе концепции строгих критериев. Эта идея также поддерживается данными, полученными в результате наблюдений морфологических характеристик сперматозоидов, связанных с зоной пеллюцида [7]. Эти сперматозоиды подобны сперматозоидам, обнаруживаемым на уровне эндоцервикса. В целях достижения хорошей воспроизводимости и надежности метода важно, чтобы интервалы нормальности были как можно меньше, поэтому описываются морфометрические параметры идеального сперматозоида. По этой же причине и в отличие от предыдущих классификаций все пограничные и с нерезко выраженной патологией формы головок относятся к патологическим. В этом заключена "строгость" указанных критериев. Предложенная пороговая точка составила 14% и более. В третьем издании ВОЗ (1992) морфологии уделяется значительно большее внимание. Главное отличие от предыдущей классификации состояло в том, что за основу были приняты строгие критерии. Всего было описано пять классов нарушений и если более чем одно нарушение на сперматозоид обнаруживалось, все эти нарушения рекомендовалось считать отдельно. Пороговая точка нормальности изменилась с 50 до 30%, однако это изменение было основано целиком на эмпирических представлениях. Последнее руководство ВОЗ (1999) рекомендует использовать в рутинной работе строгие критерии, рассматривая их как международный стандарт для оценки спермальной морфологии: «…...Строгие критерии должны быть использованы при оценке морфологической нормальности сперматозоида». Однако конкретное значение пороговой точки в последней редакции не дается в связи с незавершенностью мультицентровых популяционных исследований, связанных с оценкой спермальной морфологии. Данные, полученные из программ вспомогательных репродуктивных технологий, свидетельствуют, что при значении пороговой точки морфологии менее 15%, полученной на основании строгих критериев, частота оплодотворения in vitro снижается [8]. Методика исследования спермальной морфологии по строгим критериям Для оценки необходимо использовать окрашенный препарат эякулята (мазок эякулята на стекле). Авторами строгих критериев рекомендуется использовать окраску по Papanicolaou, однако также могут применяться другие красители, способные окрашивать части сперматозоида в разные цвета (Shorr, Diff-Quik, SperMac). Используется световая микроскопия, увеличение 1000, с масляной иммерсией и окуляром-микрометром. Должно быть подсчитано, по крайней мере, 200 сперматозоидов. Подсчет выполняется дважды, таким образом, всего оценивается 400 сперматозоидов. Двойная оценка является простейшим и эффективным элементом системы внутреннего контроля качества исследования. В счет принимается только целый сперматозоид, т.е. с головкой и хвостом. Если имеется много свободных головок или хвостов (>20% от общего числа сперматозоидов), это отмечается отдельно. Сперматозоид, не имеющий морфологических дефектов, определяется как нормальный. Все отклонения от нормальной морфологии определяются как дефекты. Все пограничные случаи также должны быть отнесены к дефектам. Сперматозоид считается нормальным, когда головка имеет ровный овальный контур с хорошо определяемой акросомой, занимающей 40—70% головки. Не должно быть дефектов шейки, средней части, хвоста. Выделяются следующие категории дефектов: — дефекты головки — большая; вытянутая; грушевидная; аморфная; круглая, маленькая, с акросомой или без; вакуолизированная (более 20% головки содержит вакуоли); малая акросома; любые комбинации; — дефекты шейки и средней части — "согнутая" шейка (шейка и хвост расположены под углом более чем 90° к продольной оси головки); асимметричное прикрепление средней части к головке; утолщенная или с неровным контуром средняя часть; тонкая средняя часть; любые комбинации; — дефекты хвоста — короткий; согнутый (более 90°); свернутый; двойной (хвост-шпилька); любые комбинации; — цитоплазматические капли (остатки цитоплазмы у основания головки)— допускается не более 30% размера нормальной головки. Нормальный сперматозоид имеет следующие морфометрические критерии: — головка, длина 4—5 мкм, ширина 2,5—3,5 мкм, отношение длины к ширине 1,50—1,75; — акросома занимает 40—70% головки; — средняя часть, длина 6—10 мкм, ширина менее 1 мкм; — хвост, длина 45 мкм. Использование микрометра в процессе подсчета рекомендуется даже опытному лаборанту, поскольку позволяет придерживаться указанных критериев и соблюсти необходимую "строгость". Прогностическое значение спермальной морфологии in vitro Опубликованы многочисленные исследования для выявления зависимости между спермальной морфологией и частотой оплодотворения in vitro. Первые основаны на различных критериях, предлагаемых ВОЗ, остальные почти все использовали строгие критерии. В 1984 г. Yovich и Stanger опубликовали данные о нормальной частоте оплодотворения, но достоверной задержке в достижении пронуклеарной стадии для группы с нарушенной морфологией (более 60% патологических, по ВОЗ, 1980). Это было первое описание связи между тератозооспермией и плохим репродуктивным потенциалом in vitro. В то время как в некоторых исследованиях (Hirsch, 1986; Jeyendren, 1986; Talbet, 1987; Rosenborg, 1990) отмечалось минимальное значение морфологии в прогнозе успеха ЭКО, в других было показано, что морфология может быть использована как наилучший прогностический фактор. Противоречивые данные, полученные в указанных исследованиях, могут быть объяснены различием используемых морфологических критериев. С введением строгих тайгербергских критериев был достигнут консенсус относительно важности оценки спермальной морфологии для ЭКО. Три начальных проспективных исследования Kruger (1986, 1987, 1988) осветили возможность прогнозирования оплодотворения в программе ЭКО у пациентов с нормальной подвижностью и концентрацией сперматозоидов [3, 4, 9]. В первом была получена пороговая точка (14% нормальных форм), выше которой частота оплодотворения и беременности была достоверно лучше. Во втором исследовании определялось прогностическое значение различных параметров эякулята для оплодотворения. Согласно полученным результатам, только морфология сперматозоидов достоверно оказывала влияние на исходы ЭКО. В третьем исследовании группа пациентов с морфологией менее 5% нормальных форм имела менее 30% оплодотворения, тогда как группа пациентов с морфологией 5% и более нормальных форм имела оплодотворение достоверно лучше. На основании проведенных исследований авторами строгих критериев были предложены две пороговые точки — 14 и 5%, при которых результаты оплодотворения in vitro достоверно различались. Исходя из прогноза оплодотво рения, может быть выделена группа пациентов, имеющих менее 5% морфологически нормальных сперматозоидов, с плохим прогнозом на оплодотворение в программе стандартного ЭКО (табл. 1). Ряд авторов подтвердили эти данные [10—12]. K. Coetzee и соавт. (1998) посредством структурного обзора литературы провели изучение действия спермальной морфологии на частоту оплодотворения и беременности. В общем, при анализе всех доступных исследований в 92% из них отмечена положительная связь между спермальной морфологией и нормальным оплодотворением in vitro. Другие показатели эякулята, в частности концентрация и подвижность, менее достоверно коррелировали с исходами ЭКО. Таким образом, на большом клиническом материале была подтверждена значимость предложенных пороговых точек (5 и 14%, табл. 2), а также обоснованность выделения группы пациентов с менее 5% морфологически нормальных сперматозоидов по строгим критериям как имеющих худший прогноз на оплодотворение в программе стандартного ЭКО. Для таких пациентов метод ИКСИ является лучшим выбором, поскольку дает больше шансов на успех лечения в целом. Таблица 1. Пороговые точки для оценки морфологии сперматозоидов Таблица 2. Средняя частота оплодотворения и беременности при пороговых точках 5 и 14% Условия, обеспечивающие ценность оценки спермальной морфологии Несомненно, что информация, полученная в результате оценки спермальной морфологии, может быть полезной только в том случае, если исследование выполнено правильно. Исследование спермальной морфологии является не только прогностически более ценным, чем другие традиционные параметры, но и более сложным, более субъективным. Несмотря на усилия, предпринимаемые ВОЗ для стандартизации исследования эякулята, сохраняются значительные различия в методике проведения оценки спермальной морфологии, а следовательно, и ошибочность, связанная с техническими этапами. Значительные вариации отмечаются при исследовании подобных образцов различными центрами, а также внутри одного центра (интра- и интерлабораторные вариации), коэффициент вариации может превышать 50% [13]. Несколько факторов могут быть ответственными за эту вариацию, включая: а) различные техники приготовления, фиксации и окрашивания мазка, б) использование различных классификационных систем, в) различный уровень опыта лаборантов. С целью стандартизации исследования, снижения вариации под эгидой ВОЗ и ESHRE (Европейская ассоциация репродукции человека и эмбриологии) в период с начала 90-х годов прошлого века и по настоящее время были организованы и проводятся следующие мероприятия: а) тренинг-курсы по сперматологии на основе текущего протокола ВОЗ с целью обучения и стандартизации; б) введение внутреннего контроля качества в протокол исследования эякулята, как критически важного и рутинного этапа исследования; в) участие центров в программах внешнего контроля качества; г) развитие и применение компьютерного анализа эякулята. Если методы приготовления и оценки слайда будут стандартизированы, это существенно снизит вариацию. Критически важным является проведение адекватного и постоянного контроля качества в сперматологической лаборатории. Простейшие схемы внутреннего контроля качества включают периодическую оценку лаборантом слайдов с заранее известным результатом, а также исследование подобных образцов разными лаборантами. При условии стандартизации внешний контроль качества, то есть контроль, проводимый независимой лабораторией, может быть ценным инструментом поддержания качества исследова ния. Опыт внедрения названных мероприятий показывает, что коэффициент вариации снижается до приемлемого уровня (менее 10%). С развитием и применением компьютерного анализа эякулята связываются большие надежды в плане достижения объективности и снижения вариабельности результатов исследования. В настоящий момент ожидаются результаты мультицентровых исследований, посвященных прогностиче ской ценности и применимости современного компьютерного анализа спермальной морфологии в практической работе. Заключение Зачатие представляет собой сложную последова тельность событий, ведущих к нормальному оплодотворению и развитию эмбриона. Отражает ли форма сперматозоида его способность совершить указанный процесс? Большинство исследований подтверждает положительную связь между числом морфологически нормальных сперматозоидов и исходом ЭКО. При снижении количества морфологически нормальных сперматозоидов менее 5% частота оплодотворения при стандартном ЭКО достоверно снижается. Для лечения таких пациентов оптимально использовать ИКСИ. Хотя нормальная морфология сперматозоидов кажется наиболее достоверным индикатором мужской фертильности, на исход ЭКО также оказывают влияние другие факторы, поэтому морфология сперматозоидов не может рассматриваться как абсолютный показатель успеха оплодотворения in vitro. Строгие критерии оценки спермальной морфологии, основанные на морфологии посткоитальных сперматозоидов, с пороговыми точками 5 и 14% являются физиологически и клинически обоснованными. Это привело к широкому распространению указанной классификационной системы с данными пороговыми точками по всему миру. Субъективная природа исследования эякулята обусловливает вероятность отклонения результата от истинного. Из этого следует необходимость стандартизации исследования, а также важность проведения внутреннего контроля качества в лаборатории, выполняющей данное исследование. При этих условиях стандартный анализ эякулята остается важной стоимостно-эффек тивной процедурой для обследования бесплодных пар и может быть использован для определения тактики ведения пары с целью достижения максимальной частоты наступления беременности. Литература 1. Jequier A.M., Ukombe E.B. Errors inherent in the performance of a routine semen analysis. Br J Urol 1983; 55: 434—436. 2. Enginsu M.E., Dumoulin C.J.M. Evaluation of human sperm morphology using strict criteria after Diff-Quik staining: correlation of morphology with fertilization in vitro. Hum Reprod 1991; 6: 854—858. 3. Kruger T.F., Menkveld R., Stanger F.S.H. et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil Steril 1986; 46: 1118—1123. 4. Kruger T.F., Acosta A.A., Simmons K.F. et al. Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization. Fertil Steril 1988; 49: 112—117. 5. Mortimer D., Leslie E.E., Kelley R.W., Templeton A.A. Morphological selection of human spermatozoa in vivo and in vitro. J Reprod Fertil 1982; 64: 391—399. 6. Fredricsson B., Bjork R. Morphology of postcoital spermatozoa in the cervical secretion and its clinical significance. Fertil Steril 1977; 28, 841—845. 7. Liu D.Y., Baker H.W.G. Morphology of spermatozoa bound to the zona pellucida of human oocytes that failed to fertilize in vitro. J Reprod Fertil 1992; 94: 71—84. 8. World Health Organization. Who Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction, 1999; CUP, 4th edn. 9. Kruger T.F., Acosta A.A., Simmons K.F. et al. New method of evaluating sperm morphology with predictive value for human in vitro fertilization. Urology 1987; 30: 248—251. 10. Liu D.Y., Baker H.W.G. The proportion of human sperm with poor morphology but normal intact acrosomes correlates with fertilization in vitro. Fertil Sterill 1988; 50: 288—293. 11. Oehninger S., Acosta A.A., Morshedi M. et al. Corrective measures and pregnancy outcome in in vitro fertilization in patients with severe sperm morphology abnormalities. Fertil Steril 1988; 50: 283—287. 12. Coetzee K., Kruger T., Lombard C. Predictive value of normal sperm morphology: a structured literature review. Hum Reprod Update 1998; 1: 73 —82. 13. Ombelet W., Pollet H., Bosmans and Vereecken A. Results of a questionnaire on sperm morphology assesment. Hum Reprod 1997; 12: 1015—1020. В.С. Петрищев, А.М. Щелочков Медицинская компания ИДК, Самара * * * Консультация Это совершенно правдивая история. Ниже приведен реальный диалог специалиста отдела по поддержке пользователей текстового редактора «Word Perfect» с клиентом (все разговоры автоматически записываются на пленку — потом Вы поймете, почему). — Помощник по компьютерам Ридж Холл, чем могу помочь? — Вы знаете, у меня проблема с Word Perfect. — Какая проблема? — Вы знаете, я набирал текст, и вдруг все слова внезапно испарились. — Испарились? — Да, они исчезли. — Хмм. И что Вы сейчас видите на экране? — Ничего. — Ничего? — Он пуст. Я не могу найти ничего, из того, что я напечатал. — Вы все еще находитесь в Word Perfect или уже вышли из него? — А как я могу это узнать? — Вы видите С: prompt на экране? — Что такое си промпт? — Хорошо, Вы можете перемещать курсор по экрану? — Здесь нет никакого курсора. Я же говорю Вам, я не вижу ничего, из того, что я напечатал. — У Вашего монитора есть индикатор напряжения? — А что такое монитор? — Это такая штука с экраном, которая выглядит как телевизор. На ней горит маленькая лампочка, которая говорит о том, что он работает? — Я не знаю. — Хорошо. Посмотрите на заднюю панель монитора и найдите там кабель питания, подключенный к нему. Вы видите его? — Да, думаю, что вижу. — Отлично. Проследите за кабелем и скажите мне, включен ли он в розетку. — Да, это так. — Осматривая заднюю панель, Вы заметили, что сзади монитора подключено два кабеля, а не один? — Нет. — Хорошо, тогда еще раз осмотрите заднюю панель и найдите второй кабель. — Да, вот он. — Проследите за кабелем и скажите мне, подключен ли он к задней панели компьютера. — Я не могу достать так далеко. — Уфф. Но вы хотя бы видите это? — Нет. — А если Вы встанете на колени и попытаетесь увидеть? — О, я не смогу этого сделать, так как я не вижу правый угол стола _ там темно. — Темно? — Да, в офисе выключен свет, и помещение освещается только из окна. — Хорошо, тогда включите свет в офисе. — Я не могу. — Почему??? — Потому что из-за аварии офис обесточен. — Обесточен ……... обесточен? Ага, хорошо. Сейчас мы все исправим. У Вас остались сопроводительные документы, коробки и упаковка, в которой Вы получали компьютер? — Да, конечно, я храню их в туалете. — Отлично. Заберите их оттуда, отключите компьютер, запакуйте его так, как Вы его получали, и отвезите в магазин, где он был куплен. — Это на самом деле необходимо? Все настолько плохо? — Боюсь, что да. — Хорошо, я надеюсь, что там все исправят. А что мне им сказать? — Скажите им, что вы слишком тупы, чтобы иметь собственный компьютер. Прислал Г. Цукерман Перевод с англ. А. Смирновой