Эндометриоз: клинико-экспериментальные сопоставления.
|
Проблема эндометриоза в настоящее время стала предметом многочисленных научных исследований с использованием разнообразных методов: клинических, эпидемиологических, гормональных, иммунологических, морфологических и др. Существует множество теорий возникновения эндометриоза, но ни одна из них не дает точного объяснения причины появления данного заболевания и механизма его развития.
Для изучения патофизиологических свойств эндометриоза создано несколько способов экспериментального индуцирования эндометриоза [1-4], однако отсутствуют данные о макроскопических и гистологических изменениях в эктопических очагах в динамике. Основным методом для подтверждения жизнеспособности эндометриоидных эктопий может являться морфологический [4-7]. В настоящее время большое внимание уделяется изучению местных факторов, в первую очередь факторов перитонеальной жидкости в патогенезе наружного генитального эндометриоза. Отдельные данные свидетельствуют о повышенной функциональной, прежде всего фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов, полученных у крыс-самок с экспериментальным эндометриозом [8]. Вместе с тем использование неспецифических объектов фагоцитоза препятствует сопоставлению полученных данных. Таким образом, имеющиеся данные литературы не позволяют сделать вывод о сходстве морфофункциональных изменений при данном заболевании у женщин и в эксперименте на животных. В этой связи нами была поставлена цель разработать модель экспериментального эндометриоза у крыс и подтвердить ее адекватность на основании клинико-экспериментальных морфологических и функциональных сопоставлений. Материал и методы Обследованы 13 женщин в возрасте 25-35 лет с нормальной репродуктивной функцией и с отсутствием патологии внутренних половых органов и 18 пациенток с бесплодием и наружным генитальным эндометриозом. Пробы перитонеальной жидкости у женщин получены при проведении лапароскопии, образцы спермы - от здоровых мужчин при обследовании в Перинатальном центре Ивановского НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава России. В контрольной группе женщин лапароскопия производилась с целью стерилизации по социальным показаниям. В остальных случаях операция была выполнена с диагностической и лечебной целями. Эксперименты выполнены на 80 крысах-самках в условиях вивария Ивановской государственной медицинской академии. Для разработки и морфологического подтверждения адекватности модели эндометриоза использовано 40 крыс: у 24 из них воспроизведение заболевания осуществляли путем аутотрансплантации фрагментов эндометрия к брюшине передней брюшной стенки, у 16 - путем свободного помещения этих фрагментов в брюшную полость. Перед оперативным вмешательством анестезия крыс проводилась подкожным введением этаминала натрия в дозе 50 мг/кг. Ход операции: после обработки передней брюшной стенки производили послойный срединный разрез. Проводили ревизию брюшной полости. Выделяли левый рог матки, перевязывали сосуды брыжейки маточного рога, рассекали рог матки на фрагменты размером 2 мм, выделяли фрагмент эндометрия. В одной группе крыс эндометрий подшивали кетгутом на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки. В другой группе крыс фрагменты эндометрия свободно помещали в каудальные отделы брюшной полости. При хирургическом вмешательстве использовались нити PROLENE фирмы ETHICON, содержащие Polyprophylene Monofilament, производства Belgium Manufacturer, Jonson and Jonson. Через 3, 6, 9 или 12 нед после операции у крыс под нембуталовым наркозом вскрывали брюшную полость, визуально осматривали и измеряли эндометриоидноподобные очаги. Материал для гистологического исследования брали путем иссечения фрагментов передней брюшной стенки с имплантатом. Материал фиксировали в нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для изучения показателей репродуктивной функции и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов использовали 40 крыс, которые были разделены на 2 группы: контрольная (20) и животные с экспериментальным эндометриозом (20). В каждой группе материал брали в разные фазы эстрального цикла (по 5 животных на каждый срок наблюдения). Для оценки репродуктивной функции у крыс исследовали длительность эстрального цикла и его фаз. С этой целью у крыс в утренние часы получали влагалищные мазки, которые исследовали после окраски азур-II-эозином по Романовскому. Исследовали клеточный состав перитонеальной жидкости и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов у женщин и крыс. Общую клеточность перитонеальной жидкости определяли путем подсчета числа ядросодержащих клеток в камере Горяева. У женщин для оценки функционального состояния перитонеальных макрофагов осуществляли их кратковременное культивирование в присутствии сперматозоидов в соответствии с методикой, описанной B. Mantovani и соавт. [9]. Процедура исследования включала следующие этапы: 1) взятие перитонеальной жидкости; 2) адгезия макрофагов к стеклу; 3) культивирование макрофагов в присутствии суспензии сперматозоидов; 4) промывание средой 199 для удаления нефагоцитированных и неадгезированных сперматозоидов и эритроцитов; 5) фиксация в 1% растворе глутарового альдегида ("Fluka", Швейцария) в среде 199 (рН 7,4) в течение 24 ч; 6) окраска препаратов по Романовскому, заключение в среду "DPX mountant" ("BDH", Великобритания) и дифференцированный подсчет клеток. При исследовании препаратов осуществляли дифференцированный подсчет макрофагов с выделением следующих функциональных классов клеток: 1) нефагоцитирующие макрофаги; 2) макрофаги, фагоцитирующие 1 сперматозоид; 3) макрофаги, фагоцитирующие 2 сперматозоида и более; 4) макрофаги, фагоцитирующие эритроциты. Культивирование макрофагов у крыс-самок с экспериментальным эндометриозом и у контрольных ложнооперированных животных проводилось через 3 нед после операции в присутствии суспензии аутологичных эритроцитов. При исследовании препаратов осуществляли дифференцированный подсчет макрофагов с выделением следующих функциональных типов клеток: неадгезирующие макрофаги, макрофаги, адгезирующие разное количество эритроцитов. В препаратах, подвергнутых осмотическому шоку и обработанных бензидиновым реактивом, выявляли нефагоцитирующие макрофаги, макрофаги с фагосомами, макрофаги с гемоглобинсодержащими включениями. Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывались в электронных таблицах "Microsoft Excel 2000" с использованием методов вариационного анализа. Сравнение средних проводилось с использованием встроенных функций "Microsoft Excel" для расчета t-критерия Стьюдента. Результаты исследования При сравнении двух способов моделирования эндометриоза у крыс установлено, что свободно помещенные в брюшную полость фрагменты эндометрия не приживаются, а подвергаются резорбции. При визуальном осмотре аутотрансплантатов, фиксированных к брюшине передней брюшной стенки, обнаружено, что через 3 нед диаметр эктопических имплантатов оставался прежним (2 мм). Очаги имели цианотический оттенок, несколько выступали над поверхностью брюшины, вокруг эндометриоидной ткани видны незначительные разрастания соединительной ткани. Через 6 нед диаметр эктопических очагов увеличивался и составил 2,5 мм; вокруг эндометриоидной ткани определялись незначительные разрастания соединительной ткани. Через 9 и 12 нед диаметр имплантатов достигал 3 мм, и в брюшной полости наблюдался выраженный спаечный процесс. При гистологическом исследовании срезов ткани передней брюшной стенки был подтвержден диагноз наружного генитального эндометриоза с наличием жизнеспособных эндометриоидных клеток. Отмечено, что у крыс с эндометриозом, полученным путем аутотрансплантации эндометриальной ткани на брюшину передней брюшной стенки, очаги располагались как в соединительной ткани, так и на границе соединительной и мышечной ткани. Выделено 2 вида кист в зависимости от типа эпителия: стромальные и эпителиальные. Обнаружено, что циклические изменения, происходящие в эндометриоидной кисте, зависят от фазы эстрального цикла. Так, в фазу эструса и метэструса полость эндометриоидной кисты выстлана цилиндрическим эпителием, а в фазу диэструса и проэструса - плоским эпителием. Жизнеспособность клеток определялась по наличию ядер, сохранивших кариолемму, четко определяемый хроматин и ядрышко, без признаков кариолизиса и кариопикноза. Однако в эндометриоидных кистах встречались вторичные изменения в виде отека, лейкоцитарной инфильтрации, дистрофии, распада клеток, кровоизлияний. Установлено, что чем больше срок наблюдения, тем более выражено прорастание кровеносных сосудов в стенку эндометриоидной кисты, что также свидетельствует о ее жизнеспособности. Так, через 3 нед отмечалось слабое прорастание кровеносных сосудов в стенку эндометриоидной кисты, через 6 нед - умеренное, а через 9 нед и более - интенсивное прорастание кровеносных сосудов. Обнаружено, что циклические изменения в эндометриоидной кисте соответствуют таковым в маточном роге. При исследовании продолжительности фаз эстрального цикла у крыс с экспериментальным эндометриозом в сравнении с ложнооперированными животными до аутотрансплантации и через 3 нед после операции отмечено, что продолжительность фаз эстрального цикла в контрольной группе крыс не изменилась, однако у крыс с эндометриозом наблюдалось увеличение продолжительности диэструса до 3,7±0,1 дней (в контроле 2,9±0,08 дней) и общей продолжительности эстрального цикла до 6,9±0,2 дня (в контроле 6,2±0,2 дня; р<0,05). При исследовании клеточного состава перитонеальной жидкости как у женщин с эндометриозом, так и у крыс с экспериментальным эндометриозом обращает на себя внимание увеличение количества макрофагов с признаками фагоцитоза по сравнению с контрольными группами (см. таблицу). Обнаружено, что повышенное количество макрофагов наблюдается во все фазы эстрального цикла у крыс. Исследование функциональной активности перитонеальных макрофагов женщин, страдающих эндометриозом, показало ее значительное усиление. Так, при эндометриозе в сравнении со здоровыми женщинами наблюдается увеличение в 2 раза числа макрофагов, фагоцитирующих 1 сперматозоид, в 2,4 раза возрастает количество макрофагов, фагоцитирующих 2 сперматозоида и более. Наблюдается усиление в 3 раза фагоцитоза аутологичных эритроцитов. В результате проведения краткосрочного культивирования перитонеальных макрофагов у крыс изучалась способность к адгезии эритроцитов. При экспериментальном эндометриозе обнаружено увеличение в 2 раза количества макрофагов, адгезирующих разное количество эритроцитов. Исследование фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов у крыс-самок с экспериментальным эндометриозом показало ее значительное усиление. Так, в группе крыс с эндометриозом в сравнении с ложнооперированными наблюдается увеличение числа макрофагов, фагоцитирующих эритроциты: макрофагов с фагосомами - в 1,2 раза, макрофагов с гемоглобинсодержащими включениями - в 2 раза. Таким образом, у крыс с экспериментальным эндометриозом наблюдается усиление как адгезионной, так и фагоцитарной активности макрофагов. Установлено, что повышенная фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов сохраняется во все фазы эстрального цикла. Обсуждение результатов В результате сравнительного анализа двух способов моделирования эндометриоза установлено, что свободно помещенные в брюшную полость фрагменты эндометриальной ткани подвергаются резорбции. Выявлено увеличение размеров эндометриоидных очагов, разрастание соединительной ткани, развитие спаечного процесса при аутотрансплантации эндометрия с фиксацией к брюшине передней брюшной стенки в динамике. Диагноз наружного генитального эндометриоза подтвержден наличием жизнеспособных эндометриоидных клеток при гистологическом исследовании. Обнаружено, что циклические изменения, происходящие в эндометриоидной кисте, зависят от фазы эстрального цикла и соответствуют таковым в маточном роге. При изучении продолжительности фаз эстрального цикла у крыс с экспериментальным эндометриозом выявлено увеличение продолжительности диэструса и общей продолжительности эстрального цикла. Это приводит к уменьшению числа эстральных циклов у животных, в том числе снижению частоты эструса, во время которого происходит оплодотворение, что может способствовать нарушению репродуктивной функции. Вместе с тем этот вопрос требует дальнейшего изучения путем определения частоты наступления беременности, особенностей ее течения, количества здоровых плодов и новорожденных. Отмечено увеличение общего числа клеток перитонеальной жидкости и макрофагов у крыс с экспериментальным эндометриозом по сравнению с контрольной группой. Нам не удалось выявить изменений в зависимости от фаз эстрального цикла, что позволяет считать фагоцитарную функцию перитонеальных макрофагов относительно независимой от уровня половых гормонов и в дальнейших исследованиях изучать эти показатели без учета фаз эстрального цикла. Эти результаты соответствуют данным, полученным при исследовании клеточного состава перитонеальной жидкости у женщин. Так, при эндометриозе число фагоцитирующих макрофагов увеличено в 3 раза по сравнению с контролем. При исследовании фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов у крыс с экспериментальным эндометриозом выявлено значительное ее усиление. Обнаружено увеличение числа макрофагов, способных к адгезии различного числа эритроцитов, и макрофагов, фагоцитирующих эритроциты. Установлено, что усиленная фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов у крыс с эндометриозом сохраняется во все фазы эстрального цикла. Аналогичные данные получены при изучении функциональной активности перитонеальных макрофагов у женщин с эндометриозом. Обнаружено усиление фагоцитарной активности по отношению к гетерологичным сперматозоидам и аутологичным эритроцитам. Заключение Установлено, что аутотрансплантация фрагментов эндометрия на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки является адекватной моделью экспериментального эндометриоза. Сравнительный анализ клеточного состава (в %) перитонеальной жидкости у женщин и крыс-самок в норме и при эндометриозе
Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия результата по сравнению с контрольной группой: одна - p < 0,01, две - p < 0,001. Это подтверждается сходством морфологической картины, изменений репродуктивной функции, клеточного состава перитонеальной жидкости и функциональной активности перитонеальных макрофагов. Представленные данные свидетельствуют о возможности использования данной модели эндометриоза для дальнейшего изучения влияния лекарственных препаратов на морфофункциональные нарушения при данном заболевании. Л.В. Посисеева, А.О. Назарова, И.Ю. Шарабанова, А.Л. Палкин, С.Б. Назаров Кафедра акушерства и гинекологии, кафедра нормальной физиологии Ивановской государственной медицинской академии, Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Минздрава РФ Литература 1. Kudoh M., Susaki Y., Ideyama Y. et al. Inhibitory effects of a novel aromatase inhibitor, YM511, on growth of endometrial explants and insulin-like growth factor-I gene expression in rats with experimental endometriosis. J Steroid Biochem Mol Biol 1997; 63: 1-3: 75-80. 2. Mizutani T., Sakata M., Terakawa N. Effect of gonadotropin-releasing hormone agonists, nafarelin, buserelin, and leuprolide, on experimentally induced endometriosis in the rat. Int J Fertil Menopausal Stud 1995; 40: 2: 106-111. 3. Sakura Y., Masaki T., Sudo K. et al. Histological studies on the therapeutic effect of sustained-release microspheres of a potent LHRH agonist (leuprorelin acetate) in an experimental endometriosis model in rats. Endocrinol Jpn 1990; 37: 5: 719-729. 4. Vernon M.W., Wilson E.A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil Steril 1985; 44: 5: 684-694. 5. Cummings A.M., Metcalf J.L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam Appl Toxicol 1995; 27: 2: 287-290. 6. Cummings A.M., Metcalf J.L., Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol Appl Pharmacol 1996; 138: 1: 131-139. 7. Mizumoto Y., Hirata J., Tokuoka S. et al. Effect of culture supernatants of endometriotic lesions, uterine endometrium and peritoneum from rats with experimental endometriosis on the natural killer activity of spleen cells. Gynec Obstet Invest 1996; 41: 2: 122-127. 8. Matsubayashi H., Makino T., Iwasaki K. et al. Leukocyte subpopulation changes in rats with autotransplanted endometrium and the effect of danazol. Am J Reprod Immunol 1995; 33: 4: 301-314. 9. Mantovani B. Phagocytosis of in vitro-aged erythrocytes - a sharp distinction between activated and normal macrophages. Exp Cell Res 1987; 173: 1: 282-286. В Интернете начал работу сайт фирмы «Солвей Фарма» на русском языке www.solvay-pharma.ru В разделе «круглые столы online» есть тема по акушерству и гинекологии. Там же Вы можете завести свой «круглый стол» и пригласить коллег из других учреждений и городов для дискуссии. Доктор: - Что Вас беспокоит? - Похоже, я не в себе: пишу сам себе письма. - Когда отправили последнее? - Сегодня днем. - Что в письме? - Откуда же я могу об этом знать, если письмо еще не пришло?
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
