Влияние андрогенов на метилирование ДНК из разных органов крыс.
|
Андрогенный препарат, содержащий эфиры тестостерона, сустанон 250 широко применяется в медицине: при эндокринной импотенции, климактерических нарушениях у мужчин, снижении умственной и физической активности, нарушении сперматогенеза и т.д. [1, 3].
Известно, что мужские половые гормоны разрыхляют суперупаковку хроматина в ядрах клеток-мишеней, что изменяет доступность различных ферментов, в том числе и метилаз, имеющих отношение к процессам метилирования ДНК [4, 7, 8]. Энзиматическое метилирование цитозиновых оснований в ДНК имеет существенное значение в регуляции активности генома эукариот [6]. В доступной отечественной и зарубежной литературе мы не встретили работ по изучению влияния комбинированного мужского полового гормона на содержание 5-метилцитозина (5-МЦ) в ДНК из разных органов высших животных. Таким образом, изучение влияния препаратов мужских половых гормонов на метилирование ДНК из разных органов высших животных является актуальным в связи с широким их применением в медицинской практике. Целью настоящих исследований явилось изучение влияния комбинированного препарата тестостерона - сустанон 250 на содержание 5-МЦ в ДНК из ядер семенников, печени и почек крыс. Материал и методы В 4 сериях экспериментов в опыте и контроле использовали по 6 беспородных крыс-самцов. Возраст животных 3 мес, масса 200±20 г. Сустанон 250 («Organon», Голландия) вводили глубоко внутримышечно в область ягодицы 1 раз в неделю (всего 4 раза) в дозе 12,5 мг на 1 кг массы, исходя из следующего расчета: 1 мл масляного коммерческого раствора содержит 250 мг препарата, который разводили в 10 раз в стерильном оливковом масле и вводили по 0,1 мл. Известно, что 1 мл указанного комбинированного препарата содержит тестостерона пропионата - 30 мг, тестостерона фенилпропионата - 60 мг, тестостерона изокапроата - 60 мг, тестостерона деканоата - 100 мг. После введения гормона мы наблюдали повышенное половое возбуждение у подопытных крыс. Животных умерщвляли методом хлороформной ингаляции. Извлеченные и предварительно взвешенные органы помещали в охлажденный трис-буфер (рН 7,50), промывали и гомогенизировали в стеклянных гомогенизаторах типа Поттера с тефлоновыми пестиками. Следует отметить, что в изученных органах патологических изменений не обнаружено. Фракцию ядер получали центрифугированием при 700 g в течение 10 мин (центрифуга ЛЗ-402, Венгрия) при температуре 0 °С. Загрязнение ядер тяжелой фракцией митохондрий контролировали под микроскопом в УФ-свете. ДНК выделяли по методу E. Kay и соавт. [11] в модификации Г.П. Бенинга [2] с нашими изменениями [8] без применения проназы. От белка освобождались путем многократного встряхивания равных объемов раствора исследуемого материала и смеси хлороформ-изобутиловый спирт (9:1). Все операции выполняли при температуре 3-5 °С. Полученную фиброзную массу ДНК наматывали на стеклянные палочки, промывали ацетоном и хранили в очищенном 80% этаноле. Препараты ДНК содержали около 1% прочно связанного белка и 1,5% РНК. Все последующие процедуры проводили по методу, описанному Б.Ф.Ванюшиным [5]. Брали по 300-400 мкг подсушенного препарата ДНК в расчете на одно пятно хроматограммы, гидролизовали до азотистых оснований в 72% хлорной кислоте в течение 1 ч при 100°С в запаянных ампулах. Азотистые основания разделяли с помощью хроматографического метода (восходящая хроматография) на бумаге FN 13 (Германия) в системе метанол-концентрированная НСl-вода (7:2:1), а 5-МЦ в системе н-бутанол-вода-концентрированный аммиак (60: 10:0,1). Разделение проводили в течение 18 ч на холоде. Количество азотистых оснований измеряли спектрофотометрически на СФ-16 «ЛОМО» и по величине оптической плотности рассчитывали в мол/%. Для каждого препарата ДНК в контроле и опыте проведено по 7-8 хроматографических исследований, причем каждый замер проводили в 3-кратной повторности. Полученные результаты обрабатывали статистически по методу Стьюдента. Результаты и обсуждение В таблице представлены полученные нами результаты изучения нуклеотидного состава и содержания Нуклеотидный состав и содержание 5-МЦ в ДНК из разных органов крыс после введения сустанона 250
Примечание. Х - среднее значение (n=10), s - среднее квадратичное отклонение. 5-МЦ в ДНК из ядер семенников, печени и почек крыс у контрольных и подопытных животных. Как видно из таблицы, у подопытных животных содержание 5-МЦ в ДНК из ядер семенников увеличилось в 3,5 раза (p<0,001), а в ДНК из печени в 2 раза (p<0,002) по сравнению с контрольными животными. Увеличение 5-МЦ в суммарной ядерной ДНК из семенников и печени крыс под влиянием экзогенного тестостерона можно объяснить следующим образом. Известно, что половые гормоны при введении in vivo связываются с гликопротеидами плазмы крови и поступают в ткани. В клетках-мишенях введенные мужские половые гормоны восстанавливаются с участием НАДФ ·Н-зависимой редуктазы и, таким образом, в семенных пузырьках возникает активная форма 5-дигидротестостерона [9]. Затем в цитоплазме клеток происходит взаимодействие восстановленных активных андрогенов с рецепторами-белками. Образовавшиеся белково-стероидные комплексы взаимодействуют с белками хроматина, изменяют упаковку хроматина и генную активность [7]. Обнаруженное нами увеличение содержания 5-МЦ в ДНК из ядер семенников и печени крыс под влиянием введенных препаратов мужских половых гормонов может быть связано с изменением доступности цитозиновой ДНК-метилтрансферазы к ДНК [10, 12]. Известно, что метильные группы являются гидрофобными. Поэтому замена атомов водорода в цитозиновых основаниях в положении 5 на метильные группы в ДНК каких-то ее участков может привести к изменению электростатического взаимодействия отрицательно заряженной ДНК с окружающими ее гистоновыми и негистоновыми белками. Это может повлиять на состояние хроматина и изменить доступность ферментов, метилирующих ДНК по цитозиновым основаниям. Следует отметить, что в почках достоверных изменений по содержанию 5-МЦ в ДНК из ядер клеток мы не обнаружили (1,20±0,15 мол/% - в контроле и 1,32±0,22 мол/% - в опыте; p>0,05). На основании полученного экспериментального материала можно придти к следующему заключению. Известно, что сустанон 250 обладает свойствами анаболического стероидного гормона. Не исключено его влияние на суперупаковку хроматина в семенниках и печени крыс, что может вызвать активацию каких-то генов, "оголение" ДНК и увеличение ее метилирования. Таким образом, введение препаратов мужских половых гормонов in vivo может повышать доступность ферментов, метилирующих ДНК, о чем косвенно судили по увеличению содержания 5-МЦ в ДНК из ядер семенников и печени крыс. Н.В. Кляшева, Н.В. Степанова, Р.И. Кляшева Кафедра биохимии медицинского института Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова, Чебоксары Литература 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. М: Мир 1994; 2: 93-253. 2. Бенинг Г.П. Получение препаратов натриевой соли ДНК из тимуса телят. В сб.: Бактериальные нуклеазы и их действие на опухолевый рост. Казань 1969; 226-231. 3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. 3-е изд. М: Медицина 1998; 274-283. 4. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК в клетках различных организмов. Успехи современной биологии 1974; 77: 3: 68-87. 5. Ванюшин Б.Ф. Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот. В кн.: Современные методы в биохимии. М: Медицина 1964; 236-250. 6. Власова Т.И., Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. Цитозиновая ДНК-метилтрансфераза из проростков пшеницы. Биохимия 1996; 61: 6: 1078-1087. 7. Жаворонкова А.Е., Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и взаимодействие с глюкокортикоидрецепторными комплексами печени крысы. Биохимия 1981; 52: 5: 870-877. 8. Кляшева Р.И. Модуляция метилирования ДНК и реорганизация структуры хроматина под влиянием витамина В и адреналина у эукариот: Автореф. дис.... д-ра биол. наук. Рязань 1996; 32. 9. Строев Е.А. Биологическая химия. М: Высшая школа 1986; 391-402. 10. Cedar H. DNA methylation and gene activity. Cell 1988; 53: 3-4. 11. Kay E., Simmons N., Dounce A. An improved preparation of sodium desoxyribonucleate. J Am Chem Soc 1952; 74: 7: 1724-1726. 12. Razin A., Cedar H., Riggs А.D. et al. DNA Methylation: Biochemistry and Biological Significance. New York: Springer Verlag 1984. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||